李明麗，秦寶福，劉繼方

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊陵 712100；2.天方藥業(yè)有限公司，河南 駐馬店 463000)

吉他霉素(Kitasamycin)，是由鏈霉菌所產(chǎn)生的一種屬于十六元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[1-2]?？咕阅芘c紅霉素近似，對(duì)大多數(shù)耐青霉素和紅霉素的金葡菌有效[3-4]。絲素粉為氨基酸水解產(chǎn)物，其為吉他霉素菌種生長(zhǎng)提供氮源。絲素粉主要成分為銨離子，銨離子對(duì)吉他霉素合成有促進(jìn)作用[5-6]，通過發(fā)酵培養(yǎng)基等量代換，使無(wú)機(jī)鹽中銨離子與絲素粉中銨離子總和的摩爾質(zhì)量相同，利用含銨離子的物質(zhì)部分或完全替代絲素粉從理論上是可行的。

1 材料與方法

1.1 菌種

吉他霉素產(chǎn)生菌北里鏈霉菌(Streptomyces kitasatoensis SK)(Zn0916-04F2)由天方藥業(yè)有限公司菌種中心提供。

1.2 培養(yǎng)基

1)斜面培養(yǎng)基：淀粉2.0 %，瓊脂粉1.5 %，pH值7.5～7.8。

2)種子培養(yǎng)基：葡萄糖1.5%，淀粉2.2%，蛋白胨1.0 %，黃豆餅粉1.8%，酵母粉0.7%，NaCl 0.5 %， CaCO30.6 %，pH值7.0～7.5。

3)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖1.5%，淀粉2.5 %，黃豆餅粉2.2 %，NH4Cl 0.4 %，KH2PO40.09 %，MnCl20.04 %，CaCO30.6 %，pH值7.0～7.5。

2 試驗(yàn)方法

(1)斜面培養(yǎng)：牛奶管接種斜面，27～29℃、培養(yǎng)7～9 d。

(2)種子培養(yǎng)：斜面接種搖瓶，27～29℃、培養(yǎng)40～50 h。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)：成熟的種子接種發(fā)酵，27～29℃、搖床轉(zhuǎn)速220～260 r/min培養(yǎng)70h左右。

(4)放大培養(yǎng)：70 m3普通機(jī)械攪拌發(fā)酵罐，27～29℃、罐壓0.010～0.040 MPa、接種量10%。

(5)效價(jià)測(cè)定：分光光度法。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 絲素粉替代物質(zhì)的優(yōu)化選擇

絲素粉為有機(jī)氮源，不如無(wú)機(jī)氮源穩(wěn)定，所以實(shí)驗(yàn)使用氯化銨、硝酸銨和硫酸銨替代絲素粉發(fā)。其結(jié)果如表1～3可以看出：氯化銨、硝酸銨不同替代比例替代效果均不穩(wěn)定且低于對(duì)照較多，硫酸銨搖瓶結(jié)果基本與對(duì)照持平，可以尋求最佳替代比例以減少影響。綜合考慮氯化銨、硝酸銨、硫酸銨[7]理化性質(zhì)、成本，硫酸銨理化性質(zhì)穩(wěn)定，價(jià)格較低、市場(chǎng)供應(yīng)充足等選定硫酸銨為最佳絲素粉替代原材料。

表1 氯化銨替代絲素粉搖瓶實(shí)驗(yàn)

表2 硝酸銨替代絲素粉搖瓶實(shí)驗(yàn)

表3 硫酸銨替代絲素粉搖瓶實(shí)驗(yàn)

3.2 硫酸銨最佳替代等量比確定

由圖1可以看出，通過發(fā)酵搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)硫酸銨與絲素粉等量比為0.75∶1的搖瓶效價(jià)高出對(duì)照較多；搖瓶液及菌絲量均正常。選擇硫酸銨與絲素粉最佳等量比0.75∶1。

圖1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3 放大驗(yàn)證

表4 等量比驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證所選最佳替代原材料及最佳替代等量比，根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在25 m3發(fā)酵罐上進(jìn)行驗(yàn)證連續(xù)10批實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

從表4中可以看出，硫酸銨以0.75∶1等量比替代絲素粉，放罐效價(jià)較絲素粉正常生產(chǎn)平均值10270 u/mL，提高7.5%，按車間生產(chǎn)成本核算可以節(jié)約成本26.78萬(wàn)元/月。產(chǎn)品質(zhì)量有所提高，組分A符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)≥85%，組分A平均值 86.04%，高于法定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)85%及平均生產(chǎn)水平87.3%。

4 討論

硫酸銨為無(wú)機(jī)鹽，其化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，質(zhì)量較蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物絲素粉穩(wěn)定，對(duì)規(guī)?；a(chǎn)有積極的意義。硫酸銨以0.75∶1等量比替代絲素粉可以穩(wěn)定效價(jià)，并有所提高，效價(jià)提高7.5%，產(chǎn)品質(zhì)量組分A提高0.6%。但硫酸銨替代絲素粉，發(fā)酵前期菌絲生長(zhǎng)較快，后期氨基氮消耗稍快，發(fā)酵過程中發(fā)酵液易產(chǎn)生泡沫，可以通過發(fā)酵罐的通風(fēng)比、攪拌等控制溶氧來(lái)調(diào)節(jié)，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。