張欣寧，吳海燕，劉永珠，姚書忠

(1.廣東省清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院婦科，廣東 清遠(yuǎn) 511500；2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科，廣東 廣州 510080)

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率位居?jì)D科惡性腫瘤之首，雖然大部分患者經(jīng)手術(shù)及術(shù)后輔助化療，病情能獲得緩解，但因遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率及復(fù)發(fā)率較高，導(dǎo)致其5年生存率仍不容樂觀。惡性腫瘤的發(fā)生是一個復(fù)雜的過程，目前認(rèn)為與原癌基因激活及抑癌基因失活有關(guān)。目前的研究認(rèn)為，Beclin 1是一種抑癌基因，具有調(diào)控細(xì)胞自噬活動的作用，在多種惡性腫瘤中均已證實(shí)表達(dá)下調(diào)[1]。而突變型 P53基因抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮重要作用[2]。目前關(guān)于兩者在宮頸癌的表達(dá)及預(yù)后相關(guān)的研究較少，因此，本研究通過觀察Beclin 1和P53在正常宮頸組織、宮頸癌組織中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系，探討其兩者在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用以及對預(yù)后的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1一般資料：收集清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院2010年1月～2012年12月的宮頸組織切片92例，切片前均未接受放療、化療治療。試驗(yàn)組為含有完整隨訪資料的子宮頸鱗癌72例，按組織分化程度：高分化33例，中低分化39例。按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO，2000)分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期32例，Ⅱa期40例，其中29例有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。對照組為正常宮頸標(biāo)本20例，患者年齡32～70歲，中位年齡48歲。所有組織標(biāo)本均使用甲醛固定后石蠟包埋切片，染色采用免疫組化SP法。

1.2結(jié)果判斷方法：Beclin l和P53陽性表現(xiàn)均為細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒。采取400倍光鏡，隨機(jī)觀察5個高倍視野，每視野計(jì)數(shù)200個細(xì)胞。按照陽性細(xì)胞所占百分比與染色深度進(jìn)行評分：無陽性細(xì)胞數(shù)為0分，陽性細(xì)胞數(shù)<30%為1分，陽性細(xì)胞數(shù)>30%為2分。染色深度評分：無染色0分；淡黃色1分；黃色至棕黃色3分；染色強(qiáng)度介于1分與3分之間為2分?？傇u分為陽性細(xì)胞百分比評分和染色深度評分之和，≤1分為陰性(-)，2～4分為弱陽性(+)，≥5分為陽性(++)，其中弱陽性和陽性均按陽性計(jì)數(shù)。所有標(biāo)本均由兩名高年資病理醫(yī)師診斷。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：數(shù)據(jù)資料采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料使用χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier生存曲線，多因素生存分析采用COX回歸分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1宮頸癌組織中Beclin 1和P53蛋白的表達(dá)結(jié)果：光鏡下顯示，Beclin 1免疫組化陽性反應(yīng)物定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，而P53陽性反應(yīng)物定位于細(xì)胞核，均表現(xiàn)為淡黃、棕黃和棕褐色顆粒。正常宮頸組織普遍著色，呈片狀分布。宮頸癌中，Beclin 1的陽性表達(dá)為45.8%，顯著低于正常宮頸組織，而P53的陽性表達(dá)為87.5%，顯著高于正常宮頸組織。見表1。

表1Beclin1和P53在不同宮頸組織中的表達(dá)情況[例(%)]

組別例數(shù)Beclin-1陽性情況P53陽性情況正常組織2017(85.0)1(5.0)宮頸癌組織7233(45.8)63(87.5)P值0.0040.000

2.2Beclin 1和P53的表達(dá)與宮頸癌臨床病理因素的關(guān)系：統(tǒng)計(jì)分析顯示，Beclinl 1的陽性率與患者年齡、癌灶大小、FIGO分期和腫瘤侵犯肌層的深度無關(guān)(P>0.05)，而與腫瘤的分化程度、有無合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。Beclin 1在33例高分化的宮頸癌組織中的陽性表達(dá)為21例，陽性率63.6%，在39例中低分化組織中陽性表達(dá)為12例，陽性率為30.8%，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.51,P=0.01)；Beclin 1在29例合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中陽性表達(dá)為8例，陽性率27.6%，43例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中陽性表達(dá)25例，陽性率58.1%，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.33,P=0.02)。P53的陽性率與患者年齡、癌灶大小、FIGO分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及肌層浸潤深度無關(guān)(P>0.05)，僅與腫瘤組織的分化程度相關(guān)。P53在33例高分化宮頸癌組織中陽性表達(dá)為25例，陽性率75.8%，在39例中低分化宮頸癌組織中陽性表達(dá)38例，陽性率97.4%，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.83,P=0.02)。

2.3Beclin l和P53的表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系：本研究入選72例宮頸癌患者均具有完整的隨訪資料，隨訪率100%，截至最后一次隨訪(2017年12月)，隨訪時(shí)間60～95個月，共計(jì)死亡19例(26.4%)，5年生存率為73.6%。經(jīng)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Beclin 1陽性患者生存時(shí)間顯著長于陰性患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011)。P53陽性表達(dá)患者生存時(shí)間與陰性表達(dá)患者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.326)(見圖1)。通過單因素生存分析顯示，早期宮頸癌的生存時(shí)間與臨床分期、組織分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤大小和Beclin 1表達(dá)相關(guān)(見表2)。經(jīng)Cox回歸分析，顯示組織分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移以及Beclin 1的表達(dá)是早期宮頸癌的預(yù)后獨(dú)立因素。見表3。

圖1 Beclin1和P53的生存曲線比較

表2宮頸癌各臨床參數(shù)與患者預(yù)后的單因素生存分析

臨床參數(shù)例數(shù)死亡(例)5年生存率(%)P值年齡 ≤50歲36877.8 >50歲361169.40.683臨床分級 Ⅰ級32487.5 Ⅱ級401562.50.042組織分化程度 高分化33390.9 中低分化391659.00.016淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有291644.8 無43393.00.002肌層浸潤深度 <1/231680.6 ≥1/2411368.30.022腫瘤大小 <4 cm43588.4 ≥4 cm291451.70.001Beclin 1表達(dá) 陽性33487.9 陰性391561.50.011P53表達(dá) 陽性631871.4 陰性9188.90.723

表3宮頸癌患者5年生存率的COX回歸多因素生存分析

預(yù)后因素BSEWaldExp(B)95% CIP值組織分化程度0.5120.2374.6211.5831.074～2.6360.026淋巴轉(zhuǎn)移0.8330.3266.3012.2581.187～4.2950.013Beclin 11.3330.5635.6043.7491.258～11.4420.018

3 討論

腫瘤的發(fā)生通常被認(rèn)為是一個多因素、多步驟的過程，不僅是細(xì)胞增殖和分化異常性疾病，同時(shí)也是凋亡異常性疾病，研究已發(fā)現(xiàn)有多種抑癌基因在惡性腫瘤的生長周期中起重要作用。自噬是真核細(xì)胞特有的生命現(xiàn)象，是細(xì)胞降解受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的一個過程。生理水平的自噬可以清除老化的細(xì)胞器，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，同時(shí)，自噬可以主動性誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，對細(xì)胞的繁殖、分化起重要的調(diào)控作用。Beclin 1基因能通過調(diào)節(jié)自噬活性調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，是哺乳動物參與自噬活動的特異性基因，其表達(dá)強(qiáng)度與自噬活性密切相關(guān)[3]。

本研究表明，Beclin 1在宮頸正常組織以陽性表達(dá)為主，而在宮頸癌中的表達(dá)為陰性和弱陽性,提示宮頸癌中存在Beclin 1的表達(dá)缺失和下調(diào)。通過臨床病理特征的對比，發(fā)現(xiàn)Beclin l的表達(dá)陽性率與宮頸癌的組織分化程度(P=0.01)和淋巴轉(zhuǎn)移(P=0.02)相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與臨床分期、病理類型以及宮頸肌層浸潤深度、腫瘤大體類型等無相關(guān)性(P>0.05)。研究結(jié)果亦與前期的研究結(jié)果相符合[4]。這個結(jié)果說明Beclin 1的表達(dá)陰性或下調(diào)不僅是宮頸癌的早期事件，而且可能在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移與侵襲能力相關(guān)，提示Beclin 1可以作為評估預(yù)后的指標(biāo)。通過對隨訪資料的進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)臨床分期、腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌灶大小和Beclin 1表達(dá)均與生存時(shí)間相關(guān)，其中Beclin 1陽性患者生存時(shí)間顯著長于陰性患者，經(jīng)COX多因素回歸分析后表明，僅臨床分期、組織分化程度和Beclin 1表達(dá)是影響患者生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)后因素。Beclin 1表達(dá)缺失會提示預(yù)后不良，可能與兩方面有關(guān)，一方面Beclin 1表達(dá)與腫瘤的組織分化和淋巴轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，而后兩者均被認(rèn)為與宮頸癌的預(yù)后密切相關(guān)，另一方面，研究表明宮頸癌細(xì)胞對化療藥物紫杉醇耐藥，機(jī)制與Beclin 1表達(dá)缺失、細(xì)胞自噬功能被抑制有關(guān)，Beclin 1陰性患者預(yù)后不良可能與化療的療效不理想有關(guān)[5]。

目前檢測的P53多為野生型P53突變而來，具有致癌特性，能夠促進(jìn)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、繁殖和細(xì)胞存活[6]，已有早期的研究證實(shí)P53與多種惡性腫瘤密切相關(guān)。本試驗(yàn)的研究結(jié)果可看出，在宮頸癌組織中P53表達(dá)的總陽性率比宮頸正常組織顯著上升，P53的表達(dá)率跟年齡、臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移以及是否深肌層浸潤無關(guān)，而與宮頸癌組織分化程度有關(guān)。說明野生型P53的突變是腫瘤發(fā)生的早期事件，其對宮頸癌細(xì)胞的凋亡作用減弱或消失，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞無限制生長，腫瘤細(xì)胞的過度增殖，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。對于P53對宮頸癌的預(yù)后評估價(jià)值，目前尚存有爭議。本研究顯示，P53不是宮頸癌的預(yù)后獨(dú)立因素，與Stiasny的研究結(jié)果符合[7]。而陳曉露的研究則認(rèn)為，宮頸癌患者中P53表達(dá)陽性者5年生存率顯著下降，為預(yù)后獨(dú)立因素，提示預(yù)后不良[8]。造成研究結(jié)果不同的原因一方面可能與研究的樣本范圍不同有關(guān)，本研究入選病例均為早期宮頸癌，臨床分期不均衡，生存率為73.6%，而陳曉露的研究包含了Ⅲ～Ⅳ期，生存率僅為47.97%，另外可能也與本研究中P53陰性樣本較少有關(guān)。

綜上所述，在宮頸癌組織中，P53表現(xiàn)為過表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生和分化密切相關(guān)，為宮頸癌的早期事件，自噬蛋白Beclin 1則表達(dá)缺失，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)。其中Beclin1表達(dá)缺失者5年生存時(shí)間縮短，為宮頸癌預(yù)后獨(dú)立因素，對于后期的治療方案制定及評估預(yù)后具有一定的指導(dǎo)意義。