許秀秀，王杰華，陳淑增，李國前，楊小霞，洪諸權(quán)

(1.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，福建 泉州 362011；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福建 泉州 362000)

腦缺血后的損傷機(jī)制復(fù)雜多樣，大量研究表明干細(xì)胞移植對(duì)腦缺血損傷可能具有令人鼓舞的治療效果。脂肪來源的干細(xì)胞 (Adipose-derived stem cell,ADSCs ) 不僅可以定向分化為神經(jīng)組織細(xì)胞，而且還能分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子。且與其他干細(xì)胞相比，ADSCs具有低免疫原性、分離難度低、體外增殖速度快等突出優(yōu)點(diǎn)。研究表明，ADSC移植對(duì)治療腦梗死有一定修復(fù)作用但其作用機(jī)制仍不清楚。生長相關(guān)蛋白-43(Growth associated protein-43,GAP-43)是一種廣泛存在于神經(jīng)組織的特異性胞膜磷酸蛋白質(zhì)。研究表明， GAP-43的表達(dá)能促進(jìn)突觸的形成、功能的維持及遞質(zhì)的釋放，被認(rèn)為是神經(jīng)元軸突生長發(fā)育的分子標(biāo)記物，提示神經(jīng)組織的損傷、修復(fù)或者再生[1]。本實(shí)驗(yàn)將研究局部注射移植ADSC對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型的治療作用并探討其可能機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選擇雄性SD大鼠，其中體重80～100 g的10只，用于獲取ADSC；體重250～280 g的36只，用于制作大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型。本研究大鼠均購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK(滬)012-0002。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑：L-DEME培養(yǎng)基來源美國Gibco公司；Percoll 淋巴細(xì)胞分離液來源美國Pharmacia公司；0.25%胰酶、胎牛血清(FBS)來源美國Hyclone公司；兔抗大鼠GAP-43一抗來源美國圣克魯斯生物技術(shù)公司；SP二步法免疫組化試劑盒、AEC染色試劑盒來源北京中山生物技術(shù)有限公司；β-actin和辣根酶標(biāo)記IgG來源上海遠(yuǎn)慕生物科技科技有限公司；Beyo ECL、Western熒光檢測(cè)試劑來源上海瑞齊實(shí)驗(yàn)試劑有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1大鼠腦缺血模型的制備：將體重為250～280 g的大鼠進(jìn)行隨機(jī)分成三組：假手術(shù)組、ADSC組和模型組。ADSC組和模型組用改良線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈梗死模型[2]，造模后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，得分為1～3分的大鼠方能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[2]。假手術(shù)組除了手術(shù)過程中不插入線栓外，其他手術(shù)步驟與模型組和ADSC組一致。

1.2.2ADSC分離及擴(kuò)增、移植：將體重為80～100 g的SD大鼠，按課題組前期的實(shí)驗(yàn)方法[3]進(jìn)行ADSC的分離培養(yǎng)與傳代，取含1×106個(gè)第3代或第4代細(xì)胞的細(xì)胞懸液30 μl，在腦立體定位儀下對(duì)造模成功24 h的ADSC組大鼠經(jīng)側(cè)腦室注射進(jìn)行移植。

1.2.3神經(jīng)功能評(píng)定：參照Longa的5分法[2]進(jìn)行評(píng)定，各組大鼠分別在術(shù)后第7天和第14天處死前行神經(jīng)功能評(píng)分。0分為無神經(jīng)功能缺損癥狀。

1.2.4模型處理和標(biāo)本取材：分別于造模后第7天、第14天進(jìn)行模型處理。用10%水合氯醛腹腔麻醉后，迅速暴露心臟，經(jīng)左心室進(jìn)行心臟灌注沖洗，取出全腦，于冰盤上迅速分離取出右半球視神經(jīng)交叉后6～11 mm部分備用。

1.2.5免疫組織化學(xué)法檢測(cè)GAP-43表達(dá)：按試劑盒說明的步驟進(jìn)行檢測(cè)，大鼠腦組織切片常規(guī)脫蠟、水化，孵育、高壓修復(fù)，加入一抗兔抗大鼠GAP-43抗體(工作濃度約為1∶200)，孵育后再加入滴加生物素化小鼠抗兔的二抗，AEC顯色，封片。用0.01 mol/L PBS在各步驟間做5 min×3次的沖洗。隨機(jī)挑選5個(gè)視野，在高倍鏡下(400倍)進(jìn)行陽性細(xì)胞數(shù)目的計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)后取其均值作為該組的陽性細(xì)胞數(shù)。

1.2.6Western blot法檢測(cè)GAP-43蛋白表達(dá)：取腦組織100 mg，按說明書進(jìn)行蛋白提取，然后測(cè)定濃度。取25 μg蛋白進(jìn)行蛋白變性、垂直電泳，轉(zhuǎn)膜封閉，按步驟加入一抗(兔抗大鼠GAP-43抗體，1∶1 500；兔抗大鼠β-actin抗體，1∶1 000)和二抗(1∶2 000)進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，ECL液顯色，呈像。測(cè)定條帶灰度值(Image J圖像分析)，比較目的蛋白灰度值和內(nèi)參β-actin灰度值，并將兩者比值作為結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1神經(jīng)功能評(píng)分：假手術(shù)組術(shù)后無神經(jīng)功能缺損癥狀，而模型組和ADSC組手術(shù)后則出現(xiàn)了明顯的神經(jīng)功能缺損，至第14天逐漸減輕。ADSC治療組與模型組比較，第7天和第14天神經(jīng)功能評(píng)分均較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

分組第7天第14天假手術(shù)組00模型組3.31±0.722.79±0.72ADSC組2.27±0.58①1.82±0.51①

注：與模型組比較，①P<0.05

2.2免疫組織化學(xué)法檢測(cè)GAP-43結(jié)果：如表2、圖1所示，假手術(shù)組GAP-43陽性細(xì)胞較少，模型組和ADSC治療組GAP-43陽性細(xì)胞表達(dá)較假手術(shù)組增加，ADSC治療組GAP-43陽性細(xì)胞明顯高于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

分組第7天第14天假手術(shù)組7.21±0.786.82±1.03模型組35.69±5.62①26.36±3.57①ADSC組57.06±7.80①②42.78±6.56①②

注：與假手術(shù)組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

圖1 各組大鼠缺血側(cè)腦組織不同時(shí)間點(diǎn)GAP-43陽性細(xì)胞的表達(dá)(×400)：A為假手術(shù)組第7天；B為模型組第7天；C為ADSC組第7天；D為假手術(shù)組第14天；E為模型組第14天；F為ADSC組第14天

圖2 各組大鼠不同時(shí)間GAP-43蛋白的表達(dá)：1為假手術(shù)組；2為模型組；3為ADSC組；A為第7天；B為第14天

2.3Western blot法檢測(cè)GAP-43結(jié)果：如表3、圖2所示。假手術(shù)組GAP-43蛋白呈低水平表達(dá)，模型組和ADSC治療組GAP-43蛋白表達(dá)較假手術(shù)組增加，ADSC治療組GAP-43蛋白明顯高于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

分組第7天第14天假手術(shù)組0.16±0.010.18±0.02模型組0.62±0.12①0.27±0.09①ADSC組0.83±0.25①②0.52±0.19①②

注：與假手術(shù)組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

3 討論

腦細(xì)胞的損傷是永久和不可逆的，因而及時(shí)進(jìn)行神經(jīng)修復(fù)尤為重要。但是由于血腦屏障的存在，利用藥物來促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)的可能性微乎其微。組織工程的飛躍發(fā)展為這些傳統(tǒng)藥物難以治療的疾病帶來福音，干細(xì)胞的研究正是其熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。干細(xì)胞的自我更新和多能分化能力對(duì)組織的修復(fù)有重要意義。脂肪來源的干細(xì)胞(ADSC)因其取材方便、來源豐富、較少引起免疫排斥、增殖速度快而受到廣大的關(guān)注[4-7]。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ADSC的分化能力，特別是向神經(jīng)方向的分化能力。但是ADSC移植對(duì)損傷性腦缺血組織的具體機(jī)制尚未完全明確。

作為神經(jīng)生長相關(guān)蛋白，GAP-43與軸突的生長密切相關(guān)，是軸突生長、發(fā)育的關(guān)鍵物質(zhì)，也是神經(jīng)損傷修復(fù)的標(biāo)志物，對(duì)突觸可塑性具有重要意義，是研究突觸重塑變化的可靠指標(biāo)。GAP-43具有一定的親水性，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。有研究認(rèn)為，在發(fā)育中神經(jīng)的分化、突觸的再生或神經(jīng)損傷后的修復(fù)等發(fā)生時(shí)，突觸在形態(tài)或者結(jié)構(gòu)上出現(xiàn)變化，可能導(dǎo)致GAP-43的高表達(dá)。在神經(jīng)系統(tǒng)中GAP-43的高水平表達(dá)對(duì)神經(jīng)元的生長、發(fā)育、再生等起到一定的促進(jìn)作用[4]。故本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)GAP-43的表達(dá)來判斷腦缺血大鼠損傷發(fā)生及ADSCs移植治療后神經(jīng)功能修復(fù)的可能性。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞發(fā)生以后，腦梗死部位組織中GAP-43蛋白表達(dá)有明顯增加，說明機(jī)體的腦組織在發(fā)生缺血性損傷后有一定的可塑性，這種可塑性與突觸的重塑有關(guān)，可能是神經(jīng)系統(tǒng)通過增加GAP-43的表達(dá)，從而進(jìn)行突觸重塑，促進(jìn)腦損傷后神經(jīng)功能的修復(fù)。但是隨著缺血時(shí)間的延長，模型組GAP-43的表達(dá)雖然較假手術(shù)組仍有明顯升高，還是有表現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)，神經(jīng)功能缺損仍然較為明顯。且在術(shù)后第7天和第14天兩個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)，ADSC治療組比模型組腦組織中GAP-43蛋白表達(dá)增加更為顯著，神經(jīng)功能缺損恢復(fù)明顯，說明大鼠腦損傷后自身進(jìn)行的神經(jīng)功能修復(fù)能力有限。而在大鼠發(fā)生腦缺血損傷后及時(shí)移植ADSC能更快促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。筆者推測(cè)移植的ADSC能通過增加GAP-43蛋白的表達(dá)，重建有利于神經(jīng)再生的微環(huán)境以促進(jìn)神經(jīng)軸突的再生，從而促進(jìn)神經(jīng)損傷的修復(fù)。因此，缺血性腦損傷后，及時(shí)進(jìn)行ADSC的移植對(duì)修復(fù)損傷性腦缺血組織，恢復(fù)神經(jīng)功能有積極的促進(jìn)作用。