李小龍，萬(wàn)征

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心內(nèi)科，天津300052）

臨床上，急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome,ACS）患者在缺血早期即可發(fā)生致死性室性心律失常[1]。目前，他汀類藥物作為治療冠狀動(dòng)脈性心臟病的常用藥，可減少室性心律失常的發(fā)生[2-3]，但機(jī)制尚未完全明確。在缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭惺倚孕穆墒?/p>

常的發(fā)生常伴隨心室肌細(xì)胞晚鈉電流（INaL）增大[4]，而缺血介導(dǎo)的心律失?？杀籌NaL抑制劑減輕[5]。本實(shí)驗(yàn)室曾報(bào)道阿托伐他汀可抑制快鈉電流（INaT）異常增大，而在細(xì)胞水平上直接觀察阿托伐他汀對(duì)INaL的研究尚罕見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬用膜片鉗方法記錄不同模擬缺血時(shí)間下大鼠左室心肌細(xì)胞INaL的變化規(guī)律及阿托伐他汀對(duì)該過(guò)程的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠40只，雄性，200～250g，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所試驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試劑和溶液 阿托伐他汀鈣購(gòu)于USP公司（批號(hào)：344423-98-9）。無(wú)鈣臺(tái)氏液（mmol/L）：NaCl 137、KCl 5.4、MgCl21、NaH2PO40.33、HEPES 10、Glucose10，以NaOH將pH調(diào)至7.4。KB液（mmol/L）：L-谷氨酸 50、KCl 40、MgCl23、KH2PO420、?；撬?20、KOH 70、EGTA 0.5、HEPES 10、Glucose 10，以 KOH將pH調(diào)至7.4。記錄INaL的電極內(nèi)液成份（mmol/L）：CsCl 140、NaCl 10、EGTA 5、HEPES 5、Na2ATP 5，以CsOH將pH調(diào)至7.3。記錄INaL的正常電極外液（以下簡(jiǎn)稱為正常外液）成份（mmol/L）：Choline-Cl 120、NaCl 25、CsOH 4、CaCl20.1、CoCl22、MgCl2l、HEPES l0、Glucose 10，以CsOH將pH調(diào)至7.4。記錄INaL的缺血電極外液（以下簡(jiǎn)稱為缺血外液）：記錄INaL的正常電極外液中去除葡萄糖，加入乳酸鈉（20 mmol/L）后，將pH調(diào)至6.8，使用前通入氮?dú)? min。將阿托伐他汀鈣3.023 mg分別溶于500 mL記錄INaL的正常電極外液和500 mL記錄INaL的缺血電極外液中即得到正常藥液和缺血藥液（阿托伐他汀濃度為5 μmol/L）。酶解液：11 mg膠原酶和 13 mg BSA 溶于40 mL無(wú)鈣臺(tái)式液。

1.3 主要儀器設(shè)備 AXON公司產(chǎn)MultiClamp 700B放大器、Diadata 1440A數(shù)模轉(zhuǎn)換器和pClampl0數(shù)據(jù)分析軟件；SUTTER公司產(chǎn)MP-285R微操作器和P-97水平微電極拉制器；OLYMPUS公司產(chǎn)IX71研究型倒置熒光顯微鏡。

1.4 細(xì)胞分離 稱重大鼠，腹腔注射肝素鈣5000IU/kg，10min后腹腔注射水合氯醛40 mg/kg麻醉；開胸取心臟，于4℃充氧無(wú)鈣臺(tái)氏液中修剪；迅速將主動(dòng)脈套扎在Langendorff灌流系統(tǒng)上；保持灌注壓70cm H2O，恒溫38.1℃，先以充氧無(wú)鈣臺(tái)氏液經(jīng)主動(dòng)脈根部灌流5 min，后以充氧酶解液循環(huán)灌流約30 min；待流速變快（約20 mL/min），心臟呈膨大松弛、外觀橘紅透明狀時(shí)，停止灌流；在充氧KB液中將左室游離壁分為若干大小相當(dāng)?shù)男募l（約10 mm×3 mm），在KB液中剪碎、吹打，使細(xì)胞散落；以200目濾網(wǎng)過(guò)濾后，在冰凍KB液中靜置2 h，以備電生理實(shí)驗(yàn)。

1.5 INaL記錄與實(shí)驗(yàn)分組 在室溫（25℃）下將細(xì)胞置于正常外液中，用正常外液以3 mL/min的速度灌流3 min，沖凈殘留KB液及細(xì)胞碎屑。電極入液后補(bǔ)償液接電位，進(jìn)行高阻封接，待穩(wěn)定1 min后補(bǔ)償電極電容，負(fù)壓吸引破膜以形成全細(xì)胞記錄模式。再次穩(wěn)定1 min后，進(jìn)行膜電容和全細(xì)胞補(bǔ)償，補(bǔ)償串聯(lián)電阻至75%，隨機(jī)分組記錄。實(shí)驗(yàn)共分4組，各組均先在正常外液中記錄基線INaL作為對(duì)照，后依照不同實(shí)驗(yàn)要求，以灌流方式更換電極外液：(1)正常組灌流正常外液；（2）缺血組灌流缺血外液，使細(xì)胞進(jìn)入模擬缺血狀態(tài)；（3）正常-他汀組灌流正常藥液，使細(xì)胞接受5 μmol/L阿托伐他汀處理；（4）缺血-他汀組灌流缺血藥液，使細(xì)胞進(jìn)入模擬缺血狀態(tài)同時(shí)接受5 μmol/L阿托伐他汀處理。灌流3 min后繼續(xù)記錄INaL，每2 min記錄1次，持續(xù)10 min，觀察INaL隨時(shí)間的變化規(guī)律。

1.6 INaL的記錄程序 鉗制電位-90 mV，測(cè)試電位從-80 mV開始，階躍5 mV，逐步去極化到+50 mV，脈寬 62.5 ms，頻率 2.5 Hz。

1.7 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 對(duì)INaL進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化[6]，觀察INaL標(biāo)準(zhǔn)化值的差異。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以表示，采用方差分析方法測(cè)定重復(fù)測(cè)量資料以觀察時(shí)間依賴性及各組間差異，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義。

2 結(jié)果

INaL的時(shí)間效應(yīng)為單細(xì)胞INaL隨時(shí)間變化，見圖1，取-40 mV測(cè)試電壓下的INaL標(biāo)準(zhǔn)化值進(jìn)行分析。

2.1 組內(nèi)比較 （1）正常組，基線狀態(tài)和記錄3、5、7、9 min等各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的INaL之間并無(wú)差別（分別P＞0.05，表 1）；（2）缺血組，模擬缺血開始后，INaL先增大后減?。▓D 1）：①模擬缺血 3～7 min 時(shí)，INaL高于基線狀態(tài)，并于3 min時(shí)達(dá)峰（表1）；②模擬缺血9min時(shí)的INaL和基線狀態(tài)比較無(wú)差別（分別P＞0.05）；（3）正常-他汀組，基線狀態(tài)和各個(gè)記錄時(shí)間點(diǎn)的INaL之間并無(wú)差別（分別 P＞0.05）；（4）缺血-他汀組，與基線狀態(tài)相比，INaL在模擬缺血5 min時(shí)減少0.43±0.31（P=0.035），在模擬缺血 7 min 時(shí)減少0.48±0.37（P=0.044）（表 1）。

2.2 組間比較 各組間基線INaL并無(wú)差異，（1）與正常組相比，缺血組INaL在記錄3～9 min內(nèi)均增大（分別 P＜0.05）；（2）與正常組相比，正常-他汀組 INaL在記錄3～9min內(nèi)均未發(fā)生明顯變化（分別 P＞0.05）；（3）與缺血組相比，缺血-他汀組INaL在記錄3～7 min時(shí)減?。ǚ謩e P＜0.05）（表 1）。

圖1 單細(xì)胞INaL圖Fig1 Single cell INaLfigure

表1 各組在不同記錄時(shí)間下的INaL標(biāo)準(zhǔn)化值（）Tab 1 The INaLstandardized values of each group at different recording time（

表1 各組在不同記錄時(shí)間下的INaL標(biāo)準(zhǔn)化值（）Tab 1 The INaLstandardized values of each group at different recording time（

F 時(shí)間=1.409，P 時(shí)間=0.265；F 區(qū)組=4.644，P 區(qū)組=0.011；F 交互=10.822；P 交互=0.000 0；與缺血組相比，*P＜0.05，ΔP＜0.01；與基線相比，#P＜0.05

基線狀態(tài)n 記錄時(shí)間正常組缺血組正常-他汀組缺血-他汀組7 7 8 6 1 1 1 1 P組間組別 3 m i n 0.8 2±0.2 4 Δ 1.7 9±0.6 6#0.8 8±0.2 8 Δ 0.8 3±0.4 6 Δ 0.0 0 0 5 m i n 1±0.3 6*1.4 6±0.6 6#1.0 6±0.2 3*0.7 2±0.4 5*#0.0 1 1 7 m i n 0.9 2±0.3 2 Δ 1.2 6±0.3 7#1.0 3±0.2 7*0.6 8±0.5 2*#0.0 0 7 9 m i n 1.0 3±0.3 8*1.2 2±0.3 6 0.9 4±0.1 9*0.7 4±0.5 2 0.1 6 6

3 討論

在正常組，各記錄時(shí)間點(diǎn)INaL標(biāo)準(zhǔn)化值與基線相比無(wú)差別，說(shuō)明正常狀態(tài)下單細(xì)胞INaL不會(huì)隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)而發(fā)生明顯變化。

由于INaT在缺血超早期存在時(shí)間依賴性變化[8]，為了觀察INaL在缺血狀態(tài)下是否也存在時(shí)間依賴性變化，本實(shí)驗(yàn)觀察了缺血10 min內(nèi)INaL的變化。又因缺血損傷的程度與缺血時(shí)間有關(guān)，為觀察INaL的瞬間變化，將觀察時(shí)間間隔設(shè)為2min。在模擬缺血3min時(shí)，INaL出現(xiàn)一過(guò)性增大并達(dá)峰。而在正常狀態(tài)下INaL在10 min內(nèi)保持不變，說(shuō)明缺血是使INaL增大的唯一因素，這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[4]。INaL的增大可引起動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)，容易引起早后除極而產(chǎn)生觸發(fā)活動(dòng)[9]；另一方面，由于缺血在時(shí)間和空間上的差異，可引起心肌動(dòng)作電位2相復(fù)極離散度和各向異性增大[10-11]，從而形成折返發(fā)生的基礎(chǔ)，因此INaL增大是缺血早期室性心律失常的重要原因之一。

INaL增大是缺血狀態(tài)引起心電活動(dòng)異常變化的機(jī)制之一，而臨床和基礎(chǔ)研究均表明他汀類藥物具有多效性作用，抑制心臟重構(gòu)、抑制神經(jīng)內(nèi)分泌激活等，甚至直接影響心室肌細(xì)胞膜離子通道功能，進(jìn)而改善細(xì)胞生存環(huán)境、改善細(xì)胞電穩(wěn)定性，從而減少室性心律失常的發(fā)生[7-9]，有一定的抗心律失常作用，因此有必要研究INaL與他汀類藥物作用之間的內(nèi)在聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)中，正常組和正常-他汀組INaL無(wú)差別，提示5 μmol/L阿托伐他汀并未對(duì)INaL產(chǎn)生作用。而有研究報(bào)道，5 μmol/L阿托伐他汀可抑制大鼠左室心室肌細(xì)胞INaT和瞬時(shí)外向鉀電流[6,12]。臨床上，阿托伐他汀的最大用量通常為80 mg/d，而2～10 μmol/L的濃度就相當(dāng)于臨床上10～80 mg/d的用藥劑量。本文認(rèn)為常規(guī)劑量阿托伐他汀不會(huì)對(duì)正常心肌細(xì)胞的INaL產(chǎn)生影響。而在缺血-他汀組中，INaL在模擬缺血3 min時(shí)的一過(guò)性增大現(xiàn)象消失，說(shuō)明5 μmol/L阿托伐他汀可以抑制模擬缺血早期INaL異常增大，起到穩(wěn)定細(xì)胞電活動(dòng)的作用，進(jìn)而有可能降低心律失常的觸發(fā)閾值，減少其發(fā)生。本文結(jié)果表明阿托伐他汀的這一作用會(huì)對(duì)急性缺血心肌誘發(fā)的室性心律失常產(chǎn)生有益的抑制效應(yīng)，從而可能減少不良心血管事件的發(fā)生。有研究顯示，增強(qiáng)的INaL可使細(xì)胞內(nèi)Na+濃度增加，激活逆模式鈉鈣交換體，導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流增加，引發(fā)心室肌細(xì)胞鈣超載，可引起晚后除極、觸發(fā)活動(dòng)和尖端扭轉(zhuǎn)性室性心律失常[13-14]。而他汀類藥物則可抑制缺血介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)[15-16]，從而減少上述鈣調(diào)控異常，進(jìn)而抑制INaL異常增大帶來(lái)的負(fù)面效應(yīng)。近年來(lái)，有報(bào)道稱他汀類可通過(guò)激活PI3-kinase/Akt信號(hào)通路拮抗上述缺血介導(dǎo)的心律失常，這或許能夠成為探討阿托伐他汀穩(wěn)定INaL的途徑之一[17]。