趙 慧 ,王春花 ,孫 蕊 ,謝 彤 ,穆 成 ,王志銳 ,巨韓芳 ,朱 澤
(1.天津醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)系,天津300070;2.天津市結(jié)核病控制中心結(jié)核參比室,天津300041)
結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種慢性傳染性疾病,我國(guó)是全球高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一[1]。結(jié)核病的診斷與防治一直是我國(guó)結(jié)核病控制工作面臨的重點(diǎn)。早期快速診斷對(duì)于結(jié)核病的治療和預(yù)防控制起著重要的作用。結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng),使用固體改良羅氏培養(yǎng)基(Lowenstein-Jensen,L-J)培養(yǎng)常常需要20 d~2個(gè)月,即使采用較先進(jìn)的全自動(dòng)分枝桿菌檢測(cè)/藥敏系統(tǒng)做液體培養(yǎng)也需要7~20 d左右。實(shí)驗(yàn)室最常用的方法是痰標(biāo)本直接涂片法,此法操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉,但是操作起來比較費(fèi)時(shí),而基層痰檢實(shí)驗(yàn)室在涂片量大的情況下1 d之內(nèi)無(wú)法得出結(jié)果,這樣的現(xiàn)狀遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足結(jié)核病臨床和防治工作的需要。近年來,熒光染色技術(shù)得到了飛速發(fā)展,作為一種研究方法或?qū)嶒?yàn)手段,已被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)各種基礎(chǔ)理論研究和臨床診斷。目前,金胺O熒光染色也逐漸應(yīng)用在結(jié)核分枝桿菌的痰涂片檢測(cè)上。本文對(duì)傳統(tǒng)的萋-尼氏抗酸染色法(簡(jiǎn)稱Z-N)和熒光染色兩種染色方法在結(jié)核分枝桿菌痰涂片鏡檢過程中的檢測(cè)效能進(jìn)行了初步的比較分析。
1.1 材料
1.1.1 標(biāo)本來源 580例標(biāo)本均來自于2012年8-12月天津市結(jié)核病控制中心門診部收取的病人送檢痰液。
1.1.2 試劑和儀器 抗酸染色試劑盒和金胺O染色試劑盒,購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司,LED熒光顯微鏡(carl ZEISS Primo Star iLED),圖像采集系統(tǒng)(ZEN.exe 1.0.1.0),Milli-Q Integral 3(A 10),NUAIR classⅡ生物安全柜(MODEL NO.NU-425-600E),BACTEC MGIT 960 (Becton Dickinson&Company)。
1.2 方法
1.2.1 標(biāo)本的確認(rèn) 痰標(biāo)本排除口水痰后納入研究范圍。確認(rèn)納入的當(dāng)天,每份痰標(biāo)本取相同位置痰液制成兩張涂片。
1.2.2 涂片染色鏡檢 每份痰樣品各涂片2張,分別進(jìn)行Z-N和熒光染色。染色時(shí),Z-N法復(fù)紅染色時(shí)采用加熱5 min,熒光染色采用金胺O冷染15~20 min。鏡檢時(shí),Z-N法在1000×鏡下觀察,金胺O法在400×鏡下觀察。具體的方法及報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)參見文獻(xiàn)[2]。
1.3 陰性對(duì)照組實(shí)驗(yàn) 用高壓滅菌后的磷酸鹽緩沖液(PBS pH=6.8)作為樣本,制作60張涂片,30張為一組,第一組采用Z-N法涂片,第二組采用熒光染色法涂片。
1.4 分枝桿菌全自動(dòng)分枝桿菌檢測(cè)/藥敏系統(tǒng)培養(yǎng) 采用BACTEC MGIT 960全自動(dòng)分枝桿菌檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行樣本培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果判定參照文獻(xiàn)[2]。
1.5 讀片時(shí)間統(tǒng)計(jì) 對(duì)納入的580張涂片進(jìn)行讀片時(shí)間的記錄,統(tǒng)計(jì)兩種染色法對(duì)同一標(biāo)本各自的讀片時(shí)間。
1.6 質(zhì)量控制 所有參與研究的人員都是經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員。納入標(biāo)本的涂片和鏡檢,均由同一名實(shí)驗(yàn)人員完成。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 兩率之間的比較采用χ2檢驗(yàn),兩種方法讀片時(shí)間上的比較采用t檢驗(yàn),P<0.05即為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 Z-N法和熒光染色法與培養(yǎng)結(jié)果的比較 580份痰標(biāo)本抗酸染色法陽(yáng)性檢出率為10.8%,熒光染色法陽(yáng)性率為15.3%,兩種方法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.118,P<0.05)(表 1,圖 1)。
表1 Z-N法和熒光染色法與培養(yǎng)結(jié)果的比較Tab 1 ComparisonbetweenZ-Nandfluorescentstainingandculture
圖1 兩種染色方法及培養(yǎng)陽(yáng)性數(shù)的比較Fig 1 Comparison betweentwostainingmethodsandpositivenumber of culture
2.2 不同檢測(cè)方法的結(jié)果分析 見表2、3。兩種染色方法的診斷符合率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=1.917,P>0.05),見表4;Z-N正確診斷指數(shù)(即約登指數(shù)=靈敏度+特異度-1)為0.398 7,熒光染色正確診斷指數(shù)為0.545 8。
表2 Z-N法與培養(yǎng)的檢測(cè)結(jié)果分析(n)Tab 2 AnalysisoftheresultsofZ-Nandculture (n)
表3 熒光染色法與培養(yǎng)的檢測(cè)結(jié)果分析(n)Tab 3 Analysisoftheresultsoffluorescentstainingandculture (n)
表4 兩種染色方法檢測(cè)對(duì)比Tab 4 Comparisonbetweentwostainingmethods
2.3 對(duì)每一例標(biāo)本在兩種染色方法中進(jìn)行分級(jí)比較 對(duì)每一級(jí)別的結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗(yàn),結(jié)果表明兩種染色方法在各陽(yáng)性分級(jí)比較中沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。另外,在陰性對(duì)照組30例中,有1例在熒光染色時(shí),20×物鏡下見到兩條疑似結(jié)核桿菌,在油鏡下確認(rèn)為并非結(jié)核桿菌(表5、6)。
表5 實(shí)驗(yàn)組Z-N染色和熒光染色結(jié)果的分級(jí)比較[n(%)]Tab5 ClassificationcomparisonbetweenZ-Nandfluorescentstaining intheexperimentalgroup [n(%)]
表6 陰性對(duì)照組Z-N染色和熒光染色的結(jié)果Tab 6 Results of Z-N and fluorescent staining in negative control group
2.4 兩種方法讀片時(shí)間比較 觀察580張涂片,抗酸染色累計(jì)用時(shí)2 505 min,平均用時(shí)4.32 min/張;熒光染色累計(jì)用時(shí)1 220 min,平均用時(shí)2.10 min/張。兩種方法的時(shí)間用t檢驗(yàn),結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)??梢?,熒光染色法的效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于抗酸染色法。見表7,圖2~9。
表7 兩種染色方法的讀片時(shí)間分析Tab 7 Analysisofthereadingtimebythetwomethods
圖2 熒光染色+(10×40)Fig 2 Fluorescent staining+(10×40)
圖3 熒光染色++(10×40)Fig 3 Fluorescent staining++(10×40)
圖4 熒光染色+++(10×40)Fig 4 Fluorescent staining+++(10×40)
圖5 熒光染色++++(10×40)Fig 5 Fluorescent staining++++(10×40)
圖6 抗酸染色+(10×100)Fig 6 Z-N+(10×100)
圖7 抗酸染色++(10×100)Fig 7 Z-N++(10×100)
圖8 抗酸染色+++(10×100)Fig 8 Z-N+++(10×100)
圖9 抗酸染色++++(10×100)Fig 9 Z-N++++(10×100)
隨著實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的進(jìn)步,分子檢測(cè)技術(shù)被更多地運(yùn)用到痰標(biāo)本檢測(cè)中。其中多色巢式熒光定量PCR(Xpert MTB/RIF)無(wú)論在靈敏度還是特異度方面都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)[3],但是考慮到明顯的成本效益和普及程度,痰涂片鏡檢在國(guó)家結(jié)核病控制規(guī)劃中仍是最有效的病人發(fā)現(xiàn)方法,傳統(tǒng)的萋-尼氏染色鏡檢是目前國(guó)內(nèi)主要的鏡檢方式[4]。不論是從結(jié)核病控制、流行病學(xué)調(diào)查和研究,還是從臨床診療的角度看,分枝桿菌的分離培養(yǎng)都是結(jié)核病病原學(xué)診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”[2]。本次研究中,以分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果為參照分析,熒光染色靈敏度(57.58%)高于Z-N靈敏度(41.67%),而兩種方法的特異度相差不大,診斷符合率也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=1.917,P>0.05);在正確診斷指數(shù)(即約登指數(shù)=靈敏度+特異度-1)方面,熒光染色(0.545 8)要高于Z-N(0.398 7),而約登指數(shù)越高,說明篩查實(shí)驗(yàn)的效果越好,真實(shí)性越大。綜合多組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),說明熒光染色法診斷效果優(yōu)于抗酸染色法。
有文獻(xiàn)報(bào)道[5]熒光染色法檢測(cè)痰中結(jié)核桿菌的靈敏度高,特異性和準(zhǔn)確率也比較高。也有報(bào)道稱[6],熒光染色法特異性與抗酸染色法相似,但敏感性平均要高10%,本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其相一致。也有報(bào)道[7]顯示,對(duì)于結(jié)果為1+的標(biāo)本,兩種染色方法的檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而對(duì)于結(jié)果為±,2+,3+,4+的標(biāo)本,兩種方法的檢出率無(wú)明顯差異,表明兩者陽(yáng)性率的差異主要體現(xiàn)在含菌量較少的痰液標(biāo)本。本實(shí)驗(yàn)與其研究并不一致,這可能與本次實(shí)驗(yàn)標(biāo)本收集時(shí)間短,數(shù)據(jù)少有關(guān)。
在操作上,抗酸染色法較熒光染色法繁瑣,加熱時(shí)易產(chǎn)生氣溶膠。熒光染色鏡檢抗酸桿菌在暗色背景下會(huì)發(fā)出橙黃色熒光,醒目易發(fā)現(xiàn)。并且熒光染色在20×物鏡視野大,鏡檢速度快,而抗酸染色100×油鏡視野小,鏡檢速度較慢。鏡檢時(shí)間的分析顯示,鏡檢580份涂片,熒光染色法的鏡檢時(shí)間要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于抗酸染色法的鏡檢時(shí)間。這對(duì)工作效率的提高有著重要的意義。有資料表明,熒光染色的假陽(yáng)性率可高達(dá)5.9%,本研究結(jié)果與之相近,在30例陰性對(duì)照標(biāo)本中,其中有1例在熒光染色時(shí),20×物鏡下見到兩條疑似結(jié)核桿菌,在油鏡下確認(rèn)為并非結(jié)核桿菌。故對(duì)于菌量少的樣本,在高倍鏡下觀察仍為疑似者,要在油鏡下再次確認(rèn)其形態(tài),方可得出結(jié)論。另外,實(shí)驗(yàn)中造成假陽(yáng)性可能原因?yàn)闊晒馊旧R檢使用的放大倍數(shù)(400×)較Z-N法鏡檢(1 000×)低,所以在菌量少的情況下,加上雜質(zhì)也會(huì)有熒光顯色的干擾,鏡下對(duì)菌體形態(tài)不容易辨認(rèn)[8]。
本研究結(jié)果表明,熒光染色鏡檢的敏感度比ZN法鏡檢提高15%多,特異度并沒有明顯降低;另外熒光染色鏡檢可以明顯縮短讀片時(shí)間,且染色無(wú)需加熱。所以使用熒光染色法鏡檢痰涂片,是一種快速、靈敏的檢測(cè)方法[9-11]。同時(shí),該方法若配套圖像采集系統(tǒng),能更直觀的看到菌體情況,為臨床診斷和患者提供更快捷、更直接的報(bào)告方式。熒光染色法更適用于日工作量較大,并且人員鏡檢經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)室。