王碩

（天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究室，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，乳腺癌防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津300060）

在女性人群中乳腺癌是一種常見的惡性腫瘤，每年將近有160萬患者被確診為乳腺癌，其中30%～40%的乳腺癌患者會發(fā)生轉(zhuǎn)移，而超過90%死亡患者發(fā)生乳腺癌轉(zhuǎn)移[1]。我國女性乳腺癌的發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)處于中低水平，但是乳腺癌仍然是我國女性最常見的癌癥之一，發(fā)病僅次于肺癌[2]。近年來乳腺癌的發(fā)病呈現(xiàn)年輕化的趨勢，因此對于乳腺癌的研究也越來越多。在研究乳腺癌的過程中動物模型的構(gòu)建是研究的關(guān)鍵所在。腫瘤細(xì)胞與小鼠品系的選擇也是建立乳腺癌動物模型的基礎(chǔ)所在，這些選擇都會對小鼠的生物學(xué)活性、成瘤率、生存期、腫瘤的惡化情況起著決定性的作用[3]。目前的報(bào)道多為人的乳腺癌細(xì)胞系異種移植到裸鼠的動物模型并且成瘤率也比較低，但是對于小鼠的乳腺癌細(xì)胞系4T1接種到裸鼠以及BABL/c小鼠身上相互對比的報(bào)道研究比較少。因此使用4T1細(xì)胞建立裸鼠以及BABL/c小鼠動物模型對于乳腺癌的研究有十分重要的作用[4-7]。本文就對相同濃度的4T1細(xì)胞分別接種到裸鼠和BABL/c小鼠身上產(chǎn)生的不同影響進(jìn)行對比，從而為乳腺癌動物模型的建立起到一個(gè)選擇性的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系和試劑 雌性裸鼠以及BABL/c小鼠各 30只，周齡 3～5周，體質(zhì)量15～18 g，購于南京大學(xué)動物模式研究所，飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院SPF動物房；4T1乳腺癌細(xì)胞株購于中科院細(xì)胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；胎牛血清和0.25%胰酶購于美國Gibco公司；PBS溶液用1 L超純 水 加 入 NaCL 8 g、KCL 0.2 g、KH2PO40.2 g、Na2HPO4·12H2O 3.48 g 濃度配置。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng) 4T1細(xì)胞（中科院細(xì)胞庫）培養(yǎng)于含有 10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS，Gibco，美國）的 RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco，美國），細(xì)胞培養(yǎng)均加入100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素，于37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對數(shù)期細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞計(jì)數(shù) 首先將計(jì)數(shù)板以及蓋玻片擦拭干凈，將蓋玻片蓋在計(jì)數(shù)板上；然后將細(xì)胞懸液吸出20 μL，滴加在蓋片邊緣，使細(xì)胞懸液充滿計(jì)數(shù)板與蓋玻片之間（主意蓋玻片與計(jì)數(shù)板之間不能有氣泡，也不可將細(xì)胞懸液流出）；最后將計(jì)數(shù)板靜止2～3 min后，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線的細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的，公式計(jì)算：細(xì)胞數(shù)/mL=四大格細(xì)胞總數(shù)/4×104。

1.2.3 乳腺癌4T1細(xì)胞懸液的制備 傳代培養(yǎng)的小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1,收集處于對數(shù)生長期的4T1細(xì)胞，用PBS清洗1次后，吸干殘余液體，加入0.25%消化，離心，然后再用PBS潤洗兩次，吸去PBS后再加入生理鹽水制備1×106的細(xì)胞懸液備用。

1.2.4 動物模型的分組以及構(gòu)建 將新到的10只裸鼠以及10只BABL/c小鼠給予正常飲食飼養(yǎng)5 d后，分別隨機(jī)分為4組每組5只，從而得到兩組每組5只的裸鼠（一組進(jìn)行正常實(shí)驗(yàn)，一組觀察生存期）以及兩組每組5只的BABL/c小鼠（一組進(jìn)行正常實(shí)驗(yàn)，一組觀察生存期）。將1×106個(gè)4T1細(xì)胞用生理鹽水稀釋后，用注射器注射到小鼠的第四脂肪墊上。

1.3 觀察指標(biāo) 注射4T1細(xì)胞后，每天觀察小鼠的生活飲食以及接種部位的腫瘤生長情況，包括腫瘤出現(xiàn)的時(shí)間，腫瘤形成的大小，成瘤率以及遠(yuǎn)期的存活率。每間隔5 d用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），并且根據(jù)V=ab2/2計(jì)算腫瘤的體積，繪制生長曲線。第30天時(shí)頸椎脫臼處死一組裸鼠一組BABL/c小鼠，取出腫瘤組織，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長短徑，計(jì)算體積，然后4%甲醛固定備用做H&E切片。取出小鼠的肺組織觀察記錄肺部表面的結(jié)節(jié)數(shù)量，然后用4%甲醛固定備用做H&E切片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05（*P＜0.05，**P＜0.01）為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組別小鼠的成瘤率以及成瘤時(shí)間 接種4T1細(xì)胞后裸鼠出現(xiàn)腫瘤的時(shí)間要早于BABL/c小鼠，由于BABL/c小鼠存在免疫能力使得裸鼠的成瘤率要高于BABL/c小鼠,具體成瘤率與腫瘤形成時(shí)間見表1。

表1 成瘤率及成瘤時(shí)間Tab 1 Tumor growth rate and tumor formation time

2.2 腫瘤大小統(tǒng)計(jì)以及病理觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在相同細(xì)胞濃度的條件下裸鼠形成腫瘤的大小明顯比BABL/c小鼠形成的腫瘤大（圖1）。兩組原位瘤用4%的甲醛固定3 d后做HE染色，比較兩組模型鼠形成的原位瘤組織學(xué)是否有區(qū)別，發(fā)現(xiàn)BABL/c組與裸鼠組形成的原位瘤都存在大量的血管結(jié)構(gòu)，沒有明顯的組織學(xué)差異（圖2）。

圖1 原位瘤的大小及統(tǒng)計(jì)Fig 1 Size and statistics of primary tumor

圖2 原位瘤HE染色Fig 2 HE staining of primary tumor

2.3 小鼠肺轉(zhuǎn)移 在30 d頸椎脫臼處死小鼠取原位瘤的同時(shí)取肺器官，然后用4%甲醛固定后觀察發(fā)現(xiàn)在肺表面都會有肺結(jié)節(jié)的存在，并且在30 d時(shí)裸鼠肺部正反雙面形成轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量明顯多于BABL/c小鼠（圖3）。HE染色組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在兩組實(shí)驗(yàn)小鼠肺轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細(xì)胞并沒有明顯差異（圖4）。

圖3 形成的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)及數(shù)量統(tǒng)計(jì)Fig 3 Lung metastasis nodules and the statistics of nodules number

圖4 肺轉(zhuǎn)移HE染色Fig 4 HE staining of lung metastasis

2.4 小鼠生存期 剩余兩組小鼠用于觀察生存期，發(fā)現(xiàn)在相同的飼養(yǎng)條件下BABL/c小鼠的生存期明顯比裸鼠的生存期長（圖5）。

圖5 小鼠的生存期Fig 5 Survival of mice

3 討論

乳腺癌動物模型的構(gòu)建與選取對于乳腺癌的研究來說一直是重點(diǎn)所在，由于大家對乳腺癌的研究方向不同，所選取的乳腺癌動物模型也不都是相同的[6，9]。在進(jìn)行乳腺癌相關(guān)實(shí)驗(yàn)時(shí)，細(xì)胞系的選擇以及小鼠品系的選擇是進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，如果細(xì)胞系和小鼠品系的選擇不合適可能就會耽誤實(shí)驗(yàn)進(jìn)程影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果?，F(xiàn)如今技術(shù)所能構(gòu)建的乳腺癌模型主要有自發(fā)性乳腺癌動物模型，誘發(fā)性乳腺癌動物模型，移植性乳腺癌動物模型，基因工程乳腺癌動物模型以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移乳腺癌動物模型[10]。

本文通過研究小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1對不同品系小鼠乳腺癌模型的影響，發(fā)現(xiàn)在注射相同數(shù)量小鼠的乳腺癌細(xì)胞4T1時(shí)，裸鼠的成瘤速度快于BABL/c小鼠，成瘤率要高于BABL/c小鼠，裸鼠的成瘤大小大于BABL/c小鼠，裸鼠的生存期比BABL/c小鼠要短。兩種小鼠在4T1細(xì)胞構(gòu)建的乳腺癌模型中都會發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，但是在相同時(shí)間內(nèi)裸鼠形成的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量明顯比BABL/c小鼠多。

綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,如果實(shí)驗(yàn)要求觀察短時(shí)間內(nèi)某基因?qū)δ[瘤的大小的影響，可以選擇4T1細(xì)胞注射裸鼠；如果實(shí)驗(yàn)要求動物模型的生存期較長，可以選擇4T1細(xì)胞注射BABL/c小鼠；如果實(shí)驗(yàn)要求觀察某基因?qū)游锬Ｐ头无D(zhuǎn)移存在的影響，可以選擇裸鼠。因此，我們在選擇乳腺癌動物模型的時(shí)候要根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體的需求而定。