程洪兵，李寒冰，張躍文，趙永旗*，韓石蕊，邵海榮，郭社民

（1.濮陽(yáng)市人民醫(yī)院，河南 濮陽(yáng) 457000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州 450046；3.濮陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，河南 濮陽(yáng) 457000）

八味大青葉洗劑是本院應(yīng)用多年的協(xié)定處方制劑，由大青葉、蛇床子、苦參、地膚子等8味中藥經(jīng)水提、醇提、濃縮等工藝制備而成的外用洗劑，八味大青葉洗劑可發(fā)揮清熱及解毒、燥濕和止癢的作用。為更好地控制藥品質(zhì)量，采用薄層色譜鑒別（TLC）[1]補(bǔ)充并改進(jìn)了本制劑中大青葉、苦參、地膚子、金銀花等4味藥材的定性鑒別；采用高效液相色譜法（HPLC）[1]對(duì)君藥蛇床子中所含蛇床子素進(jìn)行了含量測(cè)定研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法操作簡(jiǎn)便可靠，靈敏度高，可有效控制八味大青葉洗劑的質(zhì)量。

1　材料

Waters 515高效液相色譜儀；Precisa電子天平（型號(hào)：92SM-202A）；紫外可見分光光度計(jì)（型號(hào)：L6）；三用紫外儀（型號(hào)：ZF-2）；硅膠G薄層板（10 cm×20 cm，北京恒業(yè)中遠(yuǎn)化工有限公司）；2%氫氧化鈉溶液-硅膠G薄層板（10 cm×20 cm，自制）；聚酰胺薄膜（10 cm×10 cm，浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠）。大青葉的對(duì)照藥材、苦參的對(duì)照藥材、金銀花的對(duì)照藥材、地膚子皂苷Ic的對(duì)照品、蛇床子素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定研究院，批號(hào)分別為：121367-200401，121019-200304，121060-200504，111723-200602，110822-200406）；八味大青葉洗劑（批號(hào)分別為170306，170328，170410，170421）及陰性樣品均由濮陽(yáng)市人民醫(yī)院制劑室提供；甲醇、乙腈為色譜純；苯、甲苯、醋酸乙酯、三氯甲烷、丙酮、乙酸、乙醇、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、碘化鉍鉀、濃氨水、亞硝酸鈉等均為分析純；薄層層析硅膠G（60型，中國(guó)青島海洋化工集團(tuán)公司）為化學(xué)純；水為注射用水。

2　方法與結(jié)果

2.1定性鑒別[2-8]

2.1.1大青葉薄層色譜鑒別 取本品10 mL，加1%鹽酸調(diào)pH值至2～3，置分液漏斗中，加三氯甲烷振搖提取3次，每次提取10 mL，將三氯甲烷液進(jìn)行合并，之后揮干，對(duì)剩余的殘?jiān)尤? mL的三氯甲烷，使殘?jiān)芙?，將其作為供試品的溶液。?duì)缺大青葉的相關(guān)陰性樣品、陰性的對(duì)照溶液進(jìn)行制備。并取大青葉的對(duì)照藥材共1.2 g，加三氯甲烷10 mL，加熱回流1 h，給予濾過，將濾液進(jìn)行濃縮到1 mL，將其作為對(duì)照的藥材溶液。對(duì)以上3種溶液均分別吸取10 μL，點(diǎn)在同一個(gè)硅膠G薄層板的上面，將苯-三氯甲烷-丙酮（5：4：1）作為展開劑，展開并晾干之后，于日光下進(jìn)行檢視。供試品的相關(guān)色譜中，在和對(duì)照藥材的色譜所對(duì)應(yīng)的位置上，顯出相同顏色的相關(guān)斑點(diǎn)，陰性的對(duì)照溶液則沒有出現(xiàn)相關(guān)斑點(diǎn)，見圖1A（插頁(yè)二）。

2.1.2苦參薄層色譜的鑒別 取得10 mL的本品，加入濃氨試液調(diào)節(jié)其pH值到堿性，加入三氯甲烷進(jìn)行振搖并進(jìn)行3次提取，每次加入10 mL，將三氯甲烷液進(jìn)行合并，之后揮干，對(duì)剩余的殘?jiān)尤?.5 mL的三氯甲烷，使殘?jiān)芙?，將其作為供試品的溶液。?duì)缺苦參的相關(guān)陰性樣品、陰性的對(duì)照溶液進(jìn)行制備。并取苦參的對(duì)照藥材的粉末共1.2 g，加入25 mL的三氯甲烷、0.3 mL的濃氨試液，于超聲下30 min，給予濾過，將濾液進(jìn)行揮干，剩余的殘?jiān)尤?.5 mL三氯甲烷，使殘?jiān)芙猓瑢⑵渥鳛閷?duì)照的藥材溶液。對(duì)以上3種溶液均分別吸取10 μL，點(diǎn)在同一個(gè)2%的氫氧化鈉溶液-硅膠G薄層板的上面，將苯-丙酮-甲醇（8：3：0.5）作為展開劑，展開并晾干之后，將甲苯-醋酸乙酯-甲醇-水（2：4：2：1）在低于10℃放置之后的上層溶液作為展開劑，展開并晾干之后，噴上碘化鉍鉀試液以及亞硝酸鈉乙醇試液。在供試品的色譜中，在和對(duì)照藥材的色譜所對(duì)應(yīng)的位置上，顯出相同顏色的相關(guān)斑點(diǎn)，陰性的對(duì)照溶液則沒有出現(xiàn)相關(guān)斑點(diǎn)，見圖1B（插頁(yè)二）。

2.1.3地膚子薄層色譜的鑒別 取得本品共20 mL，加丙酮30 mL振搖，過濾，收集續(xù)濾液備用；取續(xù)濾液15 mL，置水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。按樣品的制備工藝制備缺地膚子的陰性的樣品，并對(duì)陰性的對(duì)照溶液進(jìn)行指標(biāo)。取地膚子皂苷Ic的對(duì)照品，加入甲醇制備每l mL含有0.5 mg的溶液，將其作為對(duì)照品的溶液。對(duì)以上3種溶液均分別吸取5 μL，點(diǎn)在同一個(gè)硅膠G薄層板的上面，將三氯甲烷-甲醇-水（16：9：2）作為展開劑，展開并晾干之后，噴上10%的硫酸乙醇溶液，使用熱風(fēng)吹到斑點(diǎn)的顯色比較清晰。供試品的色譜中，在和對(duì)照品的色譜所對(duì)應(yīng)的位置上，顯出相同的紫紅色的斑點(diǎn)，陰性的對(duì)照溶液則沒有出現(xiàn)相關(guān)斑點(diǎn)，見圖1C（插頁(yè)二）。

2.1.4金銀花薄層色譜鑒別 取2.1.3項(xiàng)續(xù)濾液5 mL，置水浴蒸干，殘?jiān)尤? mL的甲醇使之得到溶解，將其作為供試品的溶液。對(duì)缺金銀花的陰性樣品、陰性的對(duì)照溶液進(jìn)行制備。取得金銀花的對(duì)照藥材共0.2 g，加入5 mL的甲醇，給予30 min超聲處理，給予濾過，將濾液作為對(duì)照的藥材溶液。對(duì)以上3種溶液均分別吸取10 μL，點(diǎn)在同一個(gè)聚酰胺薄膜的上面，使用42%的乙酸溶液作為展開劑，展開并晾干之后，放于紫外光燈（365 nm）下面進(jìn)行檢視。供試品的色譜中，在和對(duì)照藥材的色譜所對(duì)應(yīng)的位置上，顯出相同的顏色的相關(guān)熒光斑點(diǎn)，陰性的對(duì)照溶液則沒有出現(xiàn)相關(guān)斑點(diǎn)，見圖1D（插頁(yè)二）。

2.2蛇床子素含量測(cè)定

2.2.1色譜條件 色譜柱：WelchromC18色譜柱（ 250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動(dòng)相為：乙腈-水（比例為65：35）；檢測(cè)波長(zhǎng)322 nm；流速為1.0 mL/min；理論板數(shù)按蛇床子素計(jì)算應(yīng)不低于3 000。在該條件下測(cè)定，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見圖2（插頁(yè)二）。

2.2.2溶液的制備 取適量的蛇床子素的對(duì)照品，加如乙醇制備每1 mL含有1402.0 μg的溶液，作為儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備溶液1 mL置10 mL容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。精密的量取5 mL的八味大青葉洗劑，放在50 mL的量瓶?jī)?nèi)，加入無(wú)水乙醇到刻度，給予搖勻和濾過，得到供試品的溶液 。將相同比例的處方內(nèi)不含有蛇床子的其它藥材進(jìn)行陰性樣品的制備，并對(duì)陰性的對(duì)照溶液進(jìn)行制備。

2.2.3線性關(guān)系的相關(guān)考察 準(zhǔn)確量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置25 mL容量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻。吸取20 μL注入液相色譜儀，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積。以蛇床子素面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，蛇床子素進(jìn)樣濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝39 439 X＋148 877 ，r = 0.999 8（n = 6）。結(jié)果表明，蛇床子素進(jìn)樣濃度在56～280 μg/mL范圍之內(nèi)，濃度和峰面積顯示比較良好的線性關(guān)系。

2.2.4精密度以及穩(wěn)定性的試驗(yàn) 準(zhǔn)確量取同一個(gè)對(duì)照品的溶液20 μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。以峰面積計(jì)算，RSD為 0.95%（n = 6），表明方法精密度良好。室溫放置，于0，1，2，4，8，12 h分別進(jìn)樣，記錄峰面積基本不變，RSD為0.98%，表明供試品溶液至少在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別精密量取八味大青葉洗劑（批號(hào)170328）6份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品的溶液且進(jìn)行進(jìn)樣，對(duì)峰面積進(jìn)行測(cè)定，對(duì)樣品中的蛇床子素的平均含量進(jìn)行計(jì)算得到的值為1 624.8 μg/mL，RSD為1.10%（n = 6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.6加樣回收率試驗(yàn) 精密量取八味大青葉洗劑（批號(hào)170328，蛇床子素濃度1 624.8 μg/mL）6.0，4.0，2.0 mL三個(gè)梯度各2份，分別置100 mL量瓶中；再分別對(duì)應(yīng)依次精密加入蛇床子素對(duì)照品儲(chǔ)備液（1 402.0 μg/mL）4.0，8.0，12.0 mL各2份置上述100 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇至刻度，搖勻，濾過，制得六份供試溶液。取供試溶液各20 μL，依次注入液相色譜儀，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件 測(cè)定蛇床子素含量，計(jì)算回收率。供試溶液中的蛇床子素含量以濃度單位表示，結(jié)果見表1。

2.2.7樣品含量測(cè)定 取3批供試品（批號(hào)：170306，170410，170421），依照2.2.2項(xiàng)下方法制備3份供試品的溶液，根據(jù)2.2.1中的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣，對(duì)峰面積進(jìn)行記錄，根據(jù)外標(biāo)法進(jìn)行含量計(jì)算，所得到的結(jié)果如表2。

表1　蛇床子素回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2　八味大青葉洗劑中的蛇床子素的含量的測(cè)定結(jié)果

3　討論

八味大青葉洗劑中除了含有以上檢測(cè)的5種藥材外，還含有蒼術(shù)、萊菔子、紫花地丁等3種藥材。本制劑原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有大青葉和苦參的薄層鑒別項(xiàng)，現(xiàn)增加了地膚子、金銀花的薄層鑒別項(xiàng)，完善了大青葉、苦參的薄層鑒別。金銀花薄層鑒別中，曾選用硅膠G的薄層板、硅膠H的薄層板和乙酸丁酯-甲酸-水（7：2.5：2.5）的上層溶液作為展開劑的試驗(yàn)，效果均不理想；考慮到金銀花中含有較多的黃酮類如木樨草黃素、有機(jī)酸類如綠原酸、揮發(fā)油類如芳樟醇等[9]，而聚酰胺薄膜分離上述化學(xué)成分有較好的效果，故選用聚酰胺薄膜，以乙酸為展開劑進(jìn)行展開，并對(duì)比試驗(yàn)了乙酸的3種不同濃度（42%，36%，30%），結(jié)果顯示，選用42%乙酸分離效果最理想，且斑點(diǎn)清晰。八味大青葉洗劑之君藥蛇床子，為傘形科植物蛇床的干燥成熟果實(shí)，味辛、苦、溫，具有溫腎壯陽(yáng)，燥濕，祛風(fēng)，殺蟲等作用。蛇床子含有香豆素類化合物如蛇床子素、歐前胡腦等和揮發(fā)油如蒎烯、異戊酸龍腦酯等[10]，《中國(guó)藥典》2015年版1部對(duì)蛇床子中蛇床子素的含量進(jìn)行了規(guī)定。本制劑原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)，現(xiàn)選擇蛇床子中含量較高的蛇床子素作為含量控制項(xiàng)，能側(cè)面反映本制劑的制備狀況，有助于控制制劑質(zhì)量。配制蛇床子素對(duì)照品溶液，作紫外光譜掃描，在322 nm處有最大吸收，故選取322 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。參考文獻(xiàn)報(bào)道[11-15]筆者對(duì)本制劑供試品制備、流動(dòng)相選擇、檢驗(yàn)方法學(xué)等方面做了系列研究，結(jié)果為文中所述條件最優(yōu)，結(jié)果理想。根據(jù)八味大青葉洗劑本次含量測(cè)定的結(jié)果及平時(shí)實(shí)際配制的測(cè)定情況，確定八味大青葉洗劑中所含蛇床子素每1 mL不得少于1.0 mg。為更好控制藥品質(zhì)量，今后有待進(jìn)一步開展八味大青葉洗劑中，其他藥材薄層色譜鑒別及有效成分含量測(cè)定等方面的方法學(xué)研究。