李麗靜，陳思慧，薛光輝，錢 圳，戴璐斌，周凱旋，趙國宏，馬 悅，馬曉彤，貢濟宇，劉 佳

（長春中醫(yī)藥大學，長春 130117）

AngⅡ是一種寡肽類激素，是RAAS的重要組成部分，通過RAAS過度激活，使心功能失代償，從而出現(xiàn)慢性心力衰竭的臨床癥狀[1]。本部分首先篩選AngⅡ損傷心肌細胞的最佳實驗時間和劑量，然后研究參附湯對AngⅡ損傷心肌細胞存活率、搏動頻率、相關基因Caspase-3、Beclin1和Atg5表達量的影響。

1　實驗材料

1.1實驗試劑 烏拉坦，國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品；滅菌用水，天津藥業(yè)集團新鄭股份有限公司產(chǎn)品；DMEM高糖培養(yǎng)液，胎牛血清（FBS）均為HyClone公司產(chǎn)品；D-Hank’s平衡鹽溶液，Genview公司產(chǎn)品；青霉素-鏈霉素溶液，上海碧云天生物技術有限公司產(chǎn)品；胰蛋白酶1：250、II型膠原酶、PBS緩沖溶液均為北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司產(chǎn)品；二甲基亞砜（DMSO），L-谷氨酰胺，AngⅡ，美國Sigma公司產(chǎn)品；噻唑藍（MTT），生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品；臺盼藍，上海恒遠生物科技有限公司產(chǎn)品；LDH試劑盒、CCK-8試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司產(chǎn)品；RNA提取試劑盒、逆轉錄RT PCR試劑盒、染料法熒光定量試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.2實驗動物 65只健康SPF級SD大鼠，體質(zhì)量220～240 g，雌雄各半，購自遼寧省長生生物技術有限公司，許可證號：SCXK(遼)-2010-0001。

1.3實驗藥物 參附注射液，批準文號：國藥準字Z51320632，規(guī)格：10 mL/只，由雅安三九藥業(yè)有限公司提供，臨床靜脈推注人用量5～20 mL/次，大鼠給藥劑量是臨床等效劑量的5倍[2]。參附湯水煎液的制備：按前期研究得出的參附湯治療急性心力衰竭最佳配伍比例為人參：附子＝1：2，加10體積的水，浸泡過夜，煎煮1 h/次，共3次，將上清液濾過合并，濃縮人參生藥至1 g/mL，用以備用[3]。

1.4實驗儀器 十六道生理記錄儀（MP-150），美國Biopac公司產(chǎn)品；生理信號采集分析系統(tǒng)（BL-420F），小動物呼吸機（HX-300S），成都泰盟科技有限公司產(chǎn)品；電子天平（JY4001），上海精密科學儀器有限公司產(chǎn)品；注射泵（MP-2003），上海雷恩醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；臺式低溫高速離心機（GL-21B），上海飛鴿儀器廠產(chǎn)品；酶標儀（Model 680），伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司；分析天平（FA604A），上海精天電子儀器有限公司產(chǎn)品；全自動脫水機（TP1020），組織包埋機（EG1150H），石蠟切片機（RM2235），攤片機（HI1220），干片機（HI1210），自動染色機（Autosainer XL）均為德國萊卡產(chǎn)品。

2　實驗方法

2.1心肌細胞的活性測定及培養(yǎng) 取新生72 h乳鼠10只，剪取心室部分，放入裝有D-Hank’s液的無菌玻璃平皿中，置于玻璃消化管口處[4]。將消化管放入37 ℃恒溫水浴，加入組織消化液，反復吹打消化，循環(huán)5～6次。直至消化完全，即玻璃消化管中無可見組織塊為止[4]。經(jīng)200目過濾網(wǎng)過濾，通過差速貼壁的方法分離心肌細胞和成纖維細胞。利用臺盼藍排斥實驗可用于測定細胞的活性，用細胞計數(shù)板分別對無色透明的活細胞和藍染的死細胞進行計數(shù)[5]。根據(jù)公式計算活細胞率，活細胞率大于95%，方可達到細胞學實驗研究條件。

當活細胞率大于95%，用DMEM高糖培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）培養(yǎng)至所需濃度，接種于孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。接種后每隔48 h/次換培養(yǎng)液，換液時用PBS洗去死細胞。若培養(yǎng)液配制超過一周，則需要加入少量谷氨酰胺。一般第3～4 d即可見部分細胞偽足出現(xiàn)搏動并充分伸展，培養(yǎng)至第6天細胞偽足連接成片并呈現(xiàn)統(tǒng)一的自主搏動，可用于實驗。

2.2AngⅡ致心肌肥大細胞的藥物劑量和時間篩選 在96孔培養(yǎng)板中，每空100 μL細胞懸液，設1個正常細胞組、1個空白對照組和8個阿霉素組，每組6個復孔。正常細胞組每孔加入100 μL高糖DMEM培養(yǎng)基，阿霉素組分別加入100 μL不同濃度的阿霉素高糖DMEM，使阿霉素終濃度分別為0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 mg/L。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)4、12、24、48 h。實驗結束時每孔加入10 μL MTT溶液繼續(xù)在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h。待顯微鏡下可見明顯的藍紫色甲臜顆粒后，每孔加入150 μL DMSO終止反應，震蕩培養(yǎng)箱震蕩10 min至甲臜顆粒完全溶解[6]。在490 nm波長下，用酶標儀測定各孔吸光度值（值）。按照生長抑制率公式計算不同濃度阿霉素對心肌細胞的生長抑制率。

2.3心肌細胞存活率的測定

2.3.1分組及給藥 1）正常細胞組（Sham）：10%胎牛血清的DMEM；2）AngⅡ損傷細胞組（AngⅡ）：含終濃度為10～6 mol/L AngⅡ的10%胎牛血清的DMEM；3）參附湯含藥血清：含終濃度為10～6 mol/L AngⅡ的10% 5 min含藥血清的DMEM。

2.3.2MTT法測定細胞存活率 方法同2.2。

2.3.3CCK-8試劑盒檢測細胞存活率 接種于96孔板后，每孔加入CCK-8溶液，37℃孵育4 h。在450 nm波長下，酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度值（OD值）。計算細胞存活率。

2.4自主搏動頻率的影響 將調(diào)整濃度為1×105mL的差數(shù)貼壁心肌細胞，接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL細胞懸液。培養(yǎng)致第6天時，棄去原培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞3次。將細胞分為6組，各有6個復孔，每孔加相應溶液2 mL，在熒光倒置顯微鏡下觀察給藥前、給藥后1、2、3、7、10、24 h的搏動頻率。

2.5相關基因Caspase-3、Beclin1和Atg5的表達測定

2.5.1細胞總RNA的提取 按照寶生物工程大連有限公司提供的RNA提取試劑盒說明書，提取各組細胞總RNA。

2.5.2引物設計 采用primer 510軟件設計Caspase-3、Beclin1和Atg5引物序列?；蛏嫌我铮?’→3’）下游引物（5’→3’）基因Caspase-3上游引物（5’→3）GCTGGACTGCGGTATTGAG下游引物（5’→3’）CCTGGAACATCGGATTTGATT基因Beclin1上游引物（5’→3’）GGCAGTGGCTCCTATT下游引物（5’→3’）GGCGTGCTGTGCTCTGAAAA基因Atg5上游引物（5’→3’）AGTGGAGGCAACAGAACC下游引物（5’→3’）GACACGAACTGGCACATT基因β-actin上游引物（5’→3’）CTGTATGCCTCTGGTCGTAC下游引物（5’→3’）TGATGTCACGCATTTCC。

2.5.3cDNA的合成 將抽提的RNA為模板按照寶生物工程大連有限公司cDNA試劑盒說明書，操作合成cDNA。

2.5.4Real Time PCR 依據(jù)寶生物工程大連有限公司Real Time PCR 試劑盒說明書，進行Real TimePCR操作。

2.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件，進行多組間差別用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進行相應的統(tǒng)計，組間兩兩比較用方差分析后的LSD檢驗[7]。

3　實驗結果

3.1MTT法篩選心肌細胞肥大的藥物劑量和時間 采用 MTT法檢測 AngⅡ終濃度為10-8、10-7、 10-6、10-5、10-4mol/L作用于心肌細胞12、24、48、72 h對乳鼠心肌細胞的促肥大作用。結果顯示：作用時間為48 h、作用濃度為10-6mol/L的AngⅡ?qū)π募〖毎拇俜蚀笞饔米顬槊黠@，有顯著性差異（P＜0.05），且AngⅡ?qū)π募〖毎拇俜蚀笮蕰r間-劑量依賴型5%[8]。根據(jù)實驗結果，確定建立以終濃度為10-6mol/L的AngⅡ溶液作用乳鼠心肌細胞48 h的心肌細胞肥大模型。結果見表1。

表1　不同濃度AngⅡ不同作用時間下心肌細胞存活率（± s ，n = 5）

表1　不同濃度AngⅡ不同作用時間下心肌細胞存活率（± s ，n = 5）

濃度/（mol/L）心肌細胞存活率/%12 h　24 h　48 h　72 h 0　100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.00 10-8　98.64±6.75　94.38±5.37　93.63±5.27　91.63±6.84 10-7　90.05±5.32　93.44±4.52103.49±3.31　92.54±4.63 10-6　105.49±5.23114.28±6.90128.62±4.94104.73±6.04 10-5　104.97±1.39　99.73±2.74　96.75±4.38　89.01±3.90 10-4　53.37±2.58　64.81±2.63　76.55±3.88　79.27±3.86

3.2心肌細胞存活率的影響 由實驗結果可見，與空白組對比，模型組心肌細胞存活率明顯下降（P＜0.01），參附湯含藥血清和血中移行成分均能夠提高AngⅡ損傷乳鼠心肌細胞的存活率（P＜0.01），但不同時間含藥血清之間無差異，不同含量血中移行成分見無顯著性差異。見表2。

表2　參附湯對AngⅡ損傷心肌細胞存活率的影響（± s ，n = 10）

表2　參附湯對AngⅡ損傷心肌細胞存活率的影響（± s ，n = 10）

注：與ADR組比較## P＜0.01

組 別　MTT　CCK-8正常組　99.54±5.74##　98.88±4.77##AngⅡ組　62.57±7.93　61.66±6.97 SFY 組　91.54±1.77##　91.79±2.14##

3.3自主搏動頻率的影響 由實驗結果可見，AngⅡ?qū)π募〖毎珓宇l率具有增加的作用，在24 h和48 h最為顯著（P＜0.05或P＜0.01），而在造模后48 h參附湯含藥血清5 min和血中移行成分5%對這種異常的搏動頻率有明顯的抑制作用（P＜0.05）。結果見表3。

表3　參附湯對AngⅡ損傷心肌細胞自主搏動頻率的影響（± s ，n = 5）

表3　參附湯對AngⅡ損傷心肌細胞自主搏動頻率的影響（± s ，n = 5）

注：與ADR組比較，# P＜0.05，## P＜0.01

組 別　加藥前　加藥后0 h　24 h　48 h　72 h正常組　88.07±13.08　90.17±13.13　90.51±13.51#　93.17±14.07##　93.51±15.13 Ang Ⅱ組　89.55±11.60　95.97±12.28　110.20±10.24　123.62±12.91　102.60±14.76 SFY 組　91.08±10.17　93.67±11.99　95.83±13.20　97.17±16.01#　95.45±18.12

3.4參附湯含藥血清及血中移行成分對AngⅡ損傷乳鼠心肌細胞的相關基因Caspase-3、Beclin1和Atg5表達的影響 模型組Caspasee-3、Beclin1和Atg5的mRNA表達量明顯升高（P＜0.01或P＜0.001），而參附湯含藥血清和血中移行成分可以抑制這種 mRNA表達量的升高（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表4。

表4　參附湯對AngⅡ損傷心肌細胞凋亡及自噬相關基因mRNA表達的影響（s）

4　小結

本實驗通過MTT、CCK-8法對細胞存活率的測定，篩選出建立心肌細胞肥大模型的最佳條件劑量為10-6mol/L、損傷時間為48 h。發(fā)現(xiàn)AngⅡ可以使心肌細胞的存活率明顯降低，各給藥組均可以提高AngⅡ損傷心肌細胞的存活。AngⅡ可以使心肌細胞自主搏動頻率增加，在作用24 h和48 h時呈現(xiàn)出顯著性差異，各組藥物在不同時間均可以抑制AngⅡ致心肌細胞自主搏動頻率的升高，其中SFP在作用48 h時表現(xiàn)出有顯著性差。參附湯含藥血清及血中移行成分組可降低細胞搏動頻率和抑制Caspase-3、Beclin1和Atg5的表達。推測參附湯對AngⅡ?qū)е碌男募》蚀蠹毎哂斜Ｗo作用，其機制是通過抑制細胞自噬和凋亡。