孫超,齊文靜,張蒙愛,張彭,劉振宇,張星耀

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院,山東 泰安　271000; 2.南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京　210037;3.中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所,北京　100091)

松材線蟲Bursaphelenchusxylophilus(Steineret Buhrer) Nickle是我國重要外來入侵有害生物,由其侵染引起的松材線蟲病是世界性病害,具有發(fā)病迅速、致死率高、防治困難等特征,一旦傳入,造成松林大面積死亡[1-2]。該病于1905年在日本首次發(fā)現(xiàn),目前主要分布在中國、日本、韓國、墨西哥、葡萄牙、加拿大、美國等國家[1-6];我國大陸自1982年傳入以來,逐步在我國有松林地區(qū)擴散,至2017年,江蘇、浙江、江西、山東、安徽、福建、河南、湖南、湖北、廣東、廣西、重慶、貴州、四川、陜西、遼寧等16個省的多個區(qū)縣都被列為松材線蟲病疫區(qū)[7];嚴重威脅林業(yè)生產(chǎn),破壞森林生態(tài)平衡,造成巨大經(jīng)濟損失。

松材線蟲是一種遷移性寄生線蟲,其運動行為是傳播致病的基礎(chǔ)。松材線蟲的生活史可以分為繁殖型周期和擴散型周期[8-9],線蟲在松樹個體之間的傳播依靠擴散型幼蟲。春季在松墨天牛羽化前,松材線蟲擴散型Ⅲ齡幼蟲向媒介天牛蛹室周圍運動聚集,以Ⅳ齡幼蟲狀態(tài)由天牛氣孔進入呼吸系統(tǒng)[10-11],并隨著媒介天牛補充營養(yǎng)或產(chǎn)卵時傳播至健康松樹并快速繁殖和致病[4]。另外,關(guān)于松材線蟲的致病機制一直是松材線蟲病研究的核心和重點,目前主要有毒素學(xué)說、空洞化學(xué)說、酶學(xué)說以及細菌學(xué)說[12-14]。有研究認為,松材線蟲的運動與松樹空洞化有著密切的聯(lián)系。線蟲進入樹體后沿松樹皮層和木質(zhì)部的樹脂道運動擴散,快速加劇松樹木質(zhì)部管胞空洞化,對水分運輸途徑形成毀滅性破壞[15-17]。因此,研究松材線蟲運動行為對探明其遷移運動、傳播擴散及致病機制具有十分重要意義。

運動是一種神經(jīng)行為,乙酰膽堿(acetylcholine,ACh)作為線蟲的一種重要神經(jīng)遞質(zhì),常見于中樞及周邊神經(jīng)系統(tǒng)中,參與自主神經(jīng)系統(tǒng)及體運動神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)傳導(dǎo),調(diào)節(jié)肌肉活動[18-19]。乙酰膽堿酯酶(acetylchlinesterase,AChE,EC3.1.1.7)能在膽堿神經(jīng)突觸處快速催化水解乙酰膽堿變?yōu)橐宜岷湍憠A,從而終止神經(jīng)沖動的傳遞。作者通過藥物干預(yù)神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿,探究松材線蟲受干擾后運動行為的異常特征,以期為進一步研究松材線蟲的運動行為及其所產(chǎn)生的松材線蟲病遷移擴散機制和致病機理研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1松材線蟲蟲株與菌株 灰葡萄孢Botrytiscinerea和松材線蟲蟲株NXY61為中國林業(yè)科學(xué)研究院張星耀實驗室保存菌株與蟲株。蟲株NXY61,分離自浙江寧波馬尾松松材線蟲病木,以在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上生長的灰葡萄孢菌為食,于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),4 ℃環(huán)境中長期保存。

1.2供試藥品硫酸阿托品是抗膽堿藥物,阻滯乙酰膽堿與受體結(jié)合;甲硫酸新斯的明是抗膽堿酯酶藥物,抑制乙酰膽堿酯酶活性,減緩乙酰膽堿水解造成遞質(zhì)堆積;均購自國內(nèi)試劑公司。

1.3松材線蟲的培養(yǎng)與分離將灰葡萄孢菌接種于PDA培養(yǎng)基上,25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d左右,待菌絲長滿培養(yǎng)皿后接入松材線蟲,25 ℃恒溫培養(yǎng)4～5 d,采用貝爾曼漏斗法分離松材線蟲。將分離出的松材線蟲收集到4 mL離心管中,用無菌水清洗2～3遍,用于藥物處理。

1.4硫酸阿托品對松材線蟲運動的影響向密度約為3 000頭/mL的1 mL松材線蟲水懸液內(nèi)加入濃度為0.5 mg/mL的硫酸阿托品液1 mL,未加藥物處理作為對照;在處理10,30 min,及1,3,6,12,24 h等7個時間點,取線蟲液于凹玻片凹穴中,觀察線蟲的行為特征,統(tǒng)計1 min時長的松材線蟲頭部擺動頻率、身體彎曲頻率,每次統(tǒng)計10頭線蟲,并觀察線蟲運動形態(tài)異常率,統(tǒng)計50頭線蟲。按照劉寶軍的定義[20],線蟲頭部彎曲至身體長度的1/4時定義為一次頭部擺動,1 min內(nèi)頭部擺動次數(shù)為頭部擺動頻率;假定沿著咽泵的方向為y軸,那么線蟲爬行過程中,身體沿著相應(yīng)x軸方向上的1次改變則定義為一個身體彎曲,1 min內(nèi)身體彎曲次數(shù)為身體彎曲頻率。

1.5甲硫酸新斯的明對松材線蟲運動的影響向密度約為3 000頭/mL的1 mL松材線蟲水懸液內(nèi)加入濃度為1 mg/mL的甲硫酸新斯的明液1 mL,未加藥物處理作為對照。松材線蟲頭部擺動頻率、身體彎曲頻率、運動形態(tài)異常率的觀察統(tǒng)計方法同1.4。

2　結(jié)果與分析

2.1硫酸阿托品作用下松材線蟲的運動形態(tài)異常未用藥物處理的松材線蟲在水中表現(xiàn)為明顯的泳動狀態(tài),頭部左右擺動,軀體隨頭部擺動和身體肌肉作用而呈舒展的S形前行運動,運動流暢(圖1)。

a.3齡幼蟲；b.成蟲圖1　松材線蟲正常S形運動狀態(tài)

用抗膽堿藥硫酸阿托品阻滯松材線蟲乙酰膽堿與受體結(jié)合,松材線蟲活動整體變緩慢,泳動速度降低,身體出現(xiàn)不正常扭動;隨著藥物處理時間延長,線蟲運動形態(tài)發(fā)生明顯異常,由S形變化為多節(jié)彎曲(圖2a,b,c),甚至呈螺旋狀卷曲(圖2d,e,f);各齡期幼蟲和雌雄成蟲均出現(xiàn)類似的運動異?，F(xiàn)象與規(guī)律性。

硫酸阿托品處理后,松材線蟲2齡幼蟲對藥物敏感,最先表現(xiàn)出運動形態(tài)異常,成蟲出現(xiàn)時間稍晚。在藥物處理10 min到12 h內(nèi),2齡幼蟲異常率一直最高,3齡幼蟲次之,4齡幼蟲和雌雄成蟲之間的異常率差異不大;各蟲態(tài)表現(xiàn)運動形態(tài)異常的線蟲數(shù)量隨著藥物處理時間延長而增加,24 h時,所有蟲態(tài)線蟲的運動形態(tài)異常達到100%(圖3)。

a-c.異常多節(jié)彎曲(a.4齡幼蟲，b.雌成蟲，c.雄成蟲)；d-f.異常螺旋狀卷曲(d.4齡幼蟲，e.雌成蟲，f.雄成蟲)圖2　硫酸阿托品處理后松材線蟲的運動形態(tài)異常特征

圖3　硫酸阿托品處理不同時間后松材線蟲運動形態(tài)異常率

2.2硫酸阿托品處理對松材線蟲頭部擺動頻率和身體彎曲頻率的影響硫酸阿托品處理后,松材線蟲頭部擺動頻率和身體彎曲頻率明顯降低,且隨著藥物的持續(xù)作用,頭部擺動和身體擺動受到抑制作用持續(xù)增強,擺動率持續(xù)下降,各齡幼蟲和成蟲擺動率下降規(guī)律基本一致(圖4,5)。藥物處理24 h后,2齡幼蟲完全喪失了頭部擺動的運動表現(xiàn),3齡、4齡幼蟲，雌、雄成蟲的頭部擺動頻率比0 h的頭部擺動頻率分別下降91.8%，92.0%，84.3%，83.6%(圖4)。各齡期線蟲的身體彎曲頻率也隨抑制的持續(xù)作用而不斷下降,規(guī)律基本一致。藥物處理24 h后,2齡幼蟲仍具有身體彎曲現(xiàn)象,但比0 h身體彎曲頻率下降92.9%,3齡、4齡幼蟲，雌、雄成蟲的身體彎曲頻率比0 h的線蟲身體彎曲頻率分別下降74.5%，80.0%，80.0%，76.2%(圖5)。

圖4　硫酸阿托品處理不同時間后松材線蟲頭部擺動頻率變化

圖5　硫酸阿托品處理不同時間后松材線蟲身體彎曲頻率變化

2.3甲硫酸新斯的明處理松材線蟲的運動形態(tài)的異常特征用抗膽堿酯酶藥物甲硫酸新斯的明處理松材線蟲后,在顯微鏡下觀察到線蟲總體運動形態(tài)依然呈現(xiàn)為S形,但擺動幅度較未經(jīng)藥物處理的線蟲大,間歇性出現(xiàn)短暫的不規(guī)則扭動(圖6a),有的線蟲運動時身體呈C形彎曲(圖6b),有的大程度彎曲成O形(圖6c),甚至表現(xiàn)為卷曲成團再伸展開。整體上,藥物處理后松材線蟲泳動一次的速度較未經(jīng)藥物處理的線蟲加快,圖6所示松材線蟲異常運動形態(tài),在與圖1相同的采照情況下,表現(xiàn)出因經(jīng)藥物處理后松材線蟲泳動速度加快而出現(xiàn)的照片虛化特征,而未經(jīng)藥物處理的線蟲則一直表現(xiàn)出正常的S形運動形態(tài)特征(圖1a,b)。

a.異常狀態(tài)的S形；b.異常狀態(tài)的C形；c.異常狀態(tài)的O形圖6　甲硫酸新斯的明處理后松材線蟲的運動形態(tài)

2.4甲硫酸新斯的明處理對松材線蟲頭部擺動頻率和身體彎曲頻率的影響藥物處理24 h后,相比較0 h線蟲頭部擺動頻率,2齡幼蟲上升10.8%,3齡幼蟲下降4.1%,4齡幼蟲上升14.0%,雌成蟲上升9.8%,雄成蟲下降1.8%;身體彎曲頻率與0 h線蟲身體彎曲頻率比較,2齡幼蟲上升9.5%,3齡幼蟲下降3.6%,4齡幼蟲上升1.7%,雌成蟲上升8.3%,雄成蟲上升1.6%(圖7,8)?？梢?在統(tǒng)計數(shù)據(jù)上,松材線蟲的頭部擺動頻率和身體彎曲頻率變化趨勢表現(xiàn)規(guī)律性不強,不同蟲態(tài)線蟲在不同時間點表現(xiàn)為運動頻率的升與降不一致。但是,結(jié)合松材線蟲經(jīng)藥物處理后的整體表現(xiàn),甲硫酸新斯的明能夠明顯引起松材線蟲頭部擺動頻率和身體彎曲頻率的提高,鑒于其經(jīng)藥物處理后表現(xiàn)出間歇性、短暫性的不規(guī)則扭動特征,在統(tǒng)計時間點表現(xiàn)不同的頻率數(shù)據(jù),總體體現(xiàn)出甲硫酸新斯的明對松材線蟲運動神經(jīng)系統(tǒng)興奮性作用。

圖7　甲硫酸新斯的明處理不同時間后松材線蟲頭部擺動頻率的變化

圖8　甲硫酸新斯的明處理不同時間后松材線蟲身體彎曲頻率的變化

3　結(jié)論與討論

本試驗通過兩個方向的途徑,即兩種藥物干預(yù)神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的作用,來探究其對松材線蟲運動行為產(chǎn)生的影響。途徑一是利用抗膽堿藥物硫酸阿托品阻滯遞質(zhì)不能與受體進行結(jié)合,可觀察到線蟲出現(xiàn)活動緩慢、頭部擺動頻率身體彎曲頻率持續(xù)降低的運動異常現(xiàn)象,體態(tài)呈現(xiàn)螺旋卷曲或多節(jié)彎曲的特征;途徑二是利用抗膽堿酯酶藥物甲硫酸新斯的明抑制乙酰膽堿酯酶酶活,減緩乙酰膽堿水解造成神經(jīng)遞質(zhì)堆積,可觀察到線蟲運動活性顯著增強,身體擺動幅度加劇等特征表現(xiàn)?？梢?用藥物干預(yù)方式探討松材線蟲的運動性能夠揭示松材線蟲運動行為的特征。

松材線蟲病是松材線蟲、媒介昆蟲、松樹的多元復(fù)合病害系統(tǒng),在病害系統(tǒng)中,松材線蟲與媒介昆蟲天牛之間的密切關(guān)系,是松材線蟲病在松樹樹體之間擴散傳播的重要基礎(chǔ)。松材線蟲在天牛羽化前向蛹室遷移聚集[10-11],改變松材線蟲的運動性,也許能夠改變松材線蟲向媒介昆蟲蛹室的聚集能力,在此方向上分析媒介昆蟲與松材線蟲的關(guān)系,也是一個可行的途徑?？茖W(xué)家對松材線蟲的致病機制給予了廣泛關(guān)注,空洞化一直被視為重要的致病機制[14,17,21],作為遷移性線蟲,松材線蟲在松樹樹體內(nèi)的遷移運動是否與松樹的空洞化相關(guān)？松材線蟲的高繁殖力一直被認為是松材線蟲致病的重要因素,松材線蟲在交配過程中有搜尋、接觸、交尾等系列運動特征[20],松材線蟲運動性與繁殖能力相關(guān)性、對致病的作用如何？這些問題,在本研究對松材線蟲運動性抑制的分析基礎(chǔ)上,也許可以進一步開展更多的研究探索。因此,本研究為進一步研究松材線蟲行為異常對種群擴散傳播的影響及致病機制研究提供了一個路徑。當(dāng)然,盡管本研究的目標(biāo)并未瞄向殺蟲劑藥物靶標(biāo)問題,但是乙酰膽堿酯酶作為藥物靶標(biāo)的方式和機理一直是農(nóng)藥開發(fā)和藥理學(xué)研究的主要內(nèi)容重點,同樣一些殺線劑的作用靶標(biāo)也是乙酰膽堿酯酶[19,22],因此,本研究或可為將乙酰膽堿酯酶作為藥物靶標(biāo)影響松材線蟲運動性,進而起到防治松材線蟲病的目的提供思路。