劉　瓊，王海燕，贠婷婷*，孫　敏，潘　蕊

（1.思科福（北京）生物科技有限公司，北京 100081；2.北京挑戰(zhàn)生物技術(shù)有限公司，北京 100081）

發(fā)酵前包被微囊化培養(yǎng)屎腸球菌，即在發(fā)酵前將游離屎腸球菌菌體利用微囊化技術(shù)包裹在囊中，之后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)（王婷婷等，2009），其與游離培養(yǎng)的屎腸球菌相比，菌株具有更快的生長優(yōu)勢，有效提高了菌株對高銅及胃腸液的耐受性，對微生物菌株起到了很好的保護(hù)作用，保證其生理功能的發(fā)揮，解決了益生菌作為飼料添加劑存在的效價(jià)不穩(wěn)定的問題（王婷婷等，2009）。但由于發(fā)酵前包被微囊化屎腸球菌菌體是包被到囊中以后發(fā)酵的，這就造成了囊中菌體密度過高，菌體之間緊密結(jié)合在一起，形成生物膜（Bartley等，2009），且不易分離，給后期通過稀釋涂布菌落計(jì)數(shù)的方法檢測相關(guān)產(chǎn)品中的活菌數(shù)帶來很大困難，為其相關(guān)產(chǎn)品的推廣使用帶來阻礙。

目前對前包被屎腸球菌產(chǎn)品的活菌計(jì)數(shù)主要采用振蕩法，即通過旋渦振蕩器振蕩對菌團(tuán)產(chǎn)生垂直的剪切力將其打開，但此方法受操作人員振蕩的力度、角度及時(shí)間的影響較大，使得檢測的活菌數(shù)結(jié)果差異較大，且耗時(shí)耗力，對設(shè)備損壞也較為嚴(yán)重。因此，減少人為誤差，降低檢測成本，本文結(jié)合振蕩法，使用超聲清洗器，借助超聲產(chǎn)生的空化作用將菌團(tuán)打開（劉媛麗等，2017），通過響應(yīng)面法對超聲計(jì)數(shù)條件進(jìn)行優(yōu)化，探究一種檢出率較高、較穩(wěn)定的前包被屎腸球菌相關(guān)產(chǎn)品的活菌檢測方法。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

1.1.1樣品來源前包被屎腸球菌產(chǎn)品由思科福（北京）生物科技有限公司提供。

1.1.2培養(yǎng)基膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂（北京路橋技術(shù)股份有限公司）。

1.1.3儀器與設(shè)備KQ-600KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2　試驗(yàn)方法

1.2.1樣品前處理準(zhǔn)確稱取（10±0.02）g前包被屎腸球菌樣品于滅菌的錐形瓶中，在瓶中加入適量滅菌玻璃珠，加入90 mL滅菌破囊液，放入搖床 250 r/min，25℃ 處理 40 min，制成均液，備用。

1.2.2活菌計(jì)數(shù)方法參考國標(biāo)GB4789.35-2016。

1.2.3單因素試驗(yàn)取1 mL制備好的菌懸液，加入有9 mL無菌生理鹽水的試管中，在設(shè)定條件下（考察超聲功率、超聲試管數(shù)及不同稀釋梯度試管超聲時(shí)間）超聲處理，每支試管超聲前后均用旋渦振蕩器振蕩10 s（3000 r/min，25～30下），梯度稀釋至10-9，選取10-7、10-8和10-9三個(gè)稀釋梯度平板涂布，培養(yǎng)（37℃，24 h），計(jì)數(shù)（cfu/mL），平行3組。

1.2.4響應(yīng)面分析根據(jù)單因素試驗(yàn)篩選的原菌液稀釋10倍（10-1）的試管超聲時(shí)間、梯度稀釋100倍的試管超聲時(shí)間和超聲功率三因素三水平試驗(yàn)，采用Design-Expert8.0.6軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)條件，選用Box-Behnken模型，以菌落數(shù)（cfu/g）為響應(yīng)值，做三因素三水平二次回歸正交組合試驗(yàn)，以 X1（10-1超聲時(shí)間）、X2（10-2超聲時(shí)間）、X3（超聲功率）為自變量，以菌落數(shù)（cfu/g）為響應(yīng)值（Y），進(jìn)行響應(yīng)面分析，每組平行3次，取平均值，優(yōu)化前包被腸球菌超聲計(jì)數(shù)條件。

2　結(jié)果與分析

2.1　單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1超聲功率試驗(yàn)用超聲清洗器額定功率為600 W，可調(diào)功率為240～540 W。故試驗(yàn)選取240、360 W和480 W三個(gè)梯度的超聲功率。

2.1.210-1超聲時(shí)間在超聲功率為240 W條件下，只對梯度稀釋的第一支試管即10-1進(jìn)行超聲處理，不同超聲時(shí)間對前包被屎腸球菌活菌計(jì)數(shù)結(jié)果的影響如圖1所示。

從圖1中可以看出，在10-1超聲時(shí)間為5 min時(shí)計(jì)數(shù)結(jié)果最佳。隨著超聲時(shí)間的延長，活菌數(shù)減少，說明超聲過程中產(chǎn)生的熱量及空化作用可能會(huì)造成部分屎腸球菌菌體細(xì)胞的損傷甚至死亡（劉麗艷等，2012）。因此，10-1超聲時(shí)間選擇3、5 min和7 min進(jìn)行之后的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖1　10-1超聲時(shí)間對活菌計(jì)數(shù)結(jié)果的影響

2.1.310-2超聲時(shí)間在超聲功率為240 W，10-1超聲5 min條件下，對梯度稀釋的第二支試管即10-2進(jìn)行超聲處理，不同超聲時(shí)間對前包被屎腸球菌活菌計(jì)數(shù)結(jié)果的影響如圖2所示。

從圖2中可以看出，10-2在超聲60 s時(shí)，計(jì)數(shù)結(jié)果最佳。之后隨著超聲時(shí)間的延長，活菌數(shù)出現(xiàn)減少現(xiàn)象，這是由于超聲對試管內(nèi)菌體造成的損害，且隨著稀釋倍數(shù)的增加，菌液中菌體密度大大減少，超聲對菌體的損害力度可能會(huì)增加，故10-2超聲時(shí)間選擇20、40、60 s進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

圖2　10-2超聲時(shí)間對活菌計(jì)數(shù)結(jié)果的影響

2.2響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果采用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)條件，選用Box-Behnken模型，對表1的結(jié)果進(jìn)行多原線性回歸擬合，得到活菌數(shù)對10-1超聲 時(shí) 間 T1（A）、10-2超 聲 時(shí) 間 T2（B）、超 聲功率P（C）的二次多項(xiàng)式回歸方程模型：Y=5.99521A+0.53498B+0.11018C-0.020000AB-7.45833×10-3AC-3.80208×10-4BC-0.21740A2-3.78021×10-3B2-8.66030×10-5C2-41.06531

2.2.2響應(yīng)面回歸模型方差分析為檢驗(yàn)回歸方程的有效性，進(jìn)一步確定各因素對前包被腸球菌活菌計(jì)數(shù)結(jié)果的影響，對回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2。

從表2中可以看出，模型P＜0.01，回歸影響顯著，即對計(jì)數(shù)結(jié)果影響顯著。失擬項(xiàng)P＞0.05，失擬不顯著，通過對試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂尚哦冗M(jìn)行分析，得到回歸系數(shù)R2=0.9550，方程擬合得很好，且該方程可很好描述試驗(yàn)因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，試驗(yàn)方法可靠。從方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可看出，因素 A、C、AB、BC、A2、C2對應(yīng)的 P值均大于0.01

表1　響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

表2　響應(yīng)面回歸模型方差分析

圖3～5直觀的反應(yīng)了各因素對響應(yīng)值Y的影響，給出各因素交互作用的響應(yīng)面3D與等高線分析圖。從響應(yīng)面的最高點(diǎn)和等高線可以看出，所選因素水平范圍內(nèi)存在極值，即響應(yīng)值的最高點(diǎn)。各試驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響關(guān)系為：A＞C＞B。

圖3　10-1和10-2超聲時(shí)間對活菌計(jì)數(shù)的等高線和響應(yīng)面

圖4　10-1超聲時(shí)間和超聲功率對活菌計(jì)數(shù)的等高線和響應(yīng)面

圖5　10-2超聲時(shí)間和超聲功率對活菌計(jì)數(shù)的等高線和響應(yīng)面

2.2.3優(yōu)化與驗(yàn)證試驗(yàn)根據(jù)所得模型，優(yōu)化得到最佳計(jì)數(shù)條件為：A=7 min，B=39.8 s，C=247.37 W，活菌計(jì)數(shù)結(jié)果最佳為5.28×1011cfu/g。結(jié)合實(shí)驗(yàn)用儀器及操作可行性，將優(yōu)化得到的最佳方案修改為：10-1超聲7 min，10-2超聲45 s，超聲功率240 W。進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到活菌計(jì)數(shù)結(jié)果為5.53×1011cfu/g，響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳計(jì)數(shù)條件可靠。

3　討論

本研究以前包被屎腸球菌為原料，借助超聲清洗器產(chǎn)生空化作用，采用超聲振蕩方法，通過MRS瓊脂平板涂布進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。超聲空化即液體內(nèi)的微小氣泡，在聲波的交變聲壓作用下進(jìn)入振動(dòng)狀態(tài)，當(dāng)其振蕩頻率與聲波頻率接近時(shí)，進(jìn)入共振狀態(tài)，使振動(dòng)的幅度逐漸增大，在聲波的負(fù)壓半周期內(nèi)迅速膨脹，爆破瞬間產(chǎn)生巨大力量（張偉等，2016；Miller等，2007）。借助超聲空化作用產(chǎn)生的巨大力量將前包被微膠囊中的結(jié)合緊密的菌團(tuán)打開，從而盡可能多的檢測到囊中的活菌數(shù)，但超聲強(qiáng)度及隨著超聲時(shí)間的增加產(chǎn)生的熱量會(huì)對菌體造成損害，導(dǎo)致其失活死亡。有研究表明，功率1000 W超聲時(shí)間超過5 min會(huì)對一些細(xì)菌產(chǎn)生損害（吳曉玲等，2007），因此，需要選擇適當(dāng)?shù)膹?qiáng)度和適當(dāng)?shù)某晻r(shí)間。從單因素試驗(yàn)結(jié)果可以看到，隨著超聲時(shí)間的增加，通過平板涂布計(jì)數(shù)得到的活菌數(shù)呈先增加后減少的趨勢，說明合適的超聲時(shí)間有助于微膠囊中菌團(tuán)的打開，但隨著時(shí)間不斷的增加及熱量的累積，會(huì)有大量菌體受到損傷。通過響應(yīng)面法對超聲強(qiáng)度即功率、不同稀釋梯度試管的超聲時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化得到較優(yōu)方案，之后通過多組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明其可靠性。但不同菌體及不同實(shí)驗(yàn)人員的操作存在差異，故此方法僅為之后相關(guān)產(chǎn)品的檢測提供參考，針對不同菌種及不同產(chǎn)品應(yīng)適當(dāng)做出調(diào)整。

4　結(jié)論

通過響應(yīng)面法優(yōu)化分析得到前包被屎腸球菌活菌超聲計(jì)數(shù)方法的最佳計(jì)數(shù)條件為超聲功率240 W、稀釋10倍的試管超聲7 min、稀釋100倍的試管超聲45 s，在此條件下，前包被屎腸球菌計(jì)數(shù)結(jié)果為5.53×1011cfu/g。較單因素計(jì)數(shù)結(jié)果得到了相應(yīng)的提高，證明采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲計(jì)數(shù)條件可靠，為前包被微囊化益生菌相關(guān)產(chǎn)品活菌檢測方法提供指導(dǎo)，對前包被微囊化產(chǎn)品的活菌檢測方法研究具有重要意義。