廖靜雯 張琳 張嚴焱 葉芳 曾凡星 石麗君

1北京體育大學（北京 100084）

2廣州體育學院（廣州 510500）

運動對血壓的積極調(diào)控作用已經(jīng)得到廣泛的研究和認可，各級血管形態(tài)和功能都會隨長期運動出現(xiàn)適應性變化，相比起大動脈、毛細血管和各級靜脈，小動脈即阻力血管的重塑在這個過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用[1，2]。小動脈平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）作為動脈血管壁的主要細胞類型，是決定血管反應性和血管重構(gòu)的重要因素，其增殖、遷移、凋亡以及基質(zhì)成分合成是高血壓、動脈粥樣硬化等多種心血管疾病的共同病理基礎(chǔ)；VSMC在體內(nèi)外因素的影響下表現(xiàn)為不同的功能和分化階段，均涉及VSMC的表型轉(zhuǎn)換。查閱國內(nèi)外文獻發(fā)現(xiàn)，運動調(diào)控高血壓小動脈VSMC表型轉(zhuǎn)換尚未見報道，而多個研究發(fā)現(xiàn)運動可以改善動脈粥樣硬化大動脈VSMC的功能并可能影響其表型[3-5]。在小動脈的運動適應性重塑過程中，VSMC表型調(diào)節(jié)可能發(fā)揮關(guān)鍵作用，即運動可能通過調(diào)節(jié)高血壓動脈VSMC表型轉(zhuǎn)換來實現(xiàn)對動脈形態(tài)和功能的積極影響進而調(diào)控血壓。

微小RNA（mircroRNA，miRNA，miR）作為重要的表觀調(diào)控機制之一，為探究先天和后天因素相互作用提供了新契機，對關(guān)鍵miRNA進行研究成為解釋高血壓的遺傳因素與生活方式（如運動）相互作用的良好切入點。miR-143/145在血管壁尤其是VSMC中大量表達，并且miR-143/145在正常血管壁的VSMC及處于分化狀態(tài)VSMC中表達最多[6]；大量離體和在體實驗已證實miR-143/145可維持VSMC收縮表型[7，8]。鑒于此，本研究假設長期有氧運動可能影響小動脈中miR-143/145的表達，且其變化趨勢與運動后VSMC收縮表型成正相關(guān)，而與miR-143/145緊密相關(guān)的蛋白激酶B（Pro?tein kinase B，PKB，Akt）信號通路也可能在這個過程受到激活。

VSMC中Akt信號通路的激活也對收縮表型的VSMC起正向調(diào)控作用[9]；腫瘤相關(guān)研究報道，miR-143/145靶向于Akt通路上下游多個蛋白的mRNA，兩者間呈負向調(diào)控關(guān)系[10，11]。故本研究推測，miR-143/145可能通過靶向Akt信號通路上多個蛋白來調(diào)控VSMC表型轉(zhuǎn)換；在特定的條件下（如高血壓），刺激因素（如運動）是否通過miR-143/145引起該通路中某一信號分子變化進而使原本的調(diào)節(jié)機制被打破，成為本研究待解決的問題。

本實驗對成年正常和高血壓大鼠分別進行長期有氧運動干預，觀察運動改善高血壓癥狀的同時是否可以調(diào)節(jié)腸系膜動脈VSMC的表型；檢測運動干預是否影響動脈血管中miR-143/145的表達，觀察Akt信號通路主要蛋白的激活情況，并結(jié)合離體實驗對腸系膜動脈VSMC分離培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染干預，以進行進一步的機制研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

3月齡正常大鼠（Wistar Kyoto rats，WKY）和原發(fā)性高血壓大鼠（Spontaneously hypertensive rats，SHR）購自北京維通利華實驗動物中心，實驗動物批號為11400700074310，使用許可證號為SCXK（京）2012-0001，SHR和WKY各分為安靜對照組（WKY-C和SHR-C）和運動干預組（WKY-E和SHR-E），每組20只，每籠4只。國家標準嚙齒動物飼料喂養(yǎng)，自由飲食和飲水。清潔級動物飼養(yǎng)房溫度為20～25℃，相對濕度為45%～55%，晝夜12/12小時照明。

1.2 運動干預方案

各組大鼠先進行1周的適應性訓練結(jié)束后，運動組進行8周的正式有氧跑臺訓練（速度為20 m/min，坡度為0，每周5天，每天60 min），運動方案參考文獻[12，13]中遞增負荷跑臺訓練及在預實驗中對大鼠最大攝氧量的測定，訓練強度相當于55%～65%VO2max。安靜對照組大鼠于各籠內(nèi)飼養(yǎng)8周，不進行任何運動干預。分別于正式運動干預前及取材前對各組大鼠進行血壓和心率的測量，具體方法參照以往的研究[14]。

1.3 HEHE染色

大鼠麻醉后取腸系膜動脈（2～3級）剝離粘連組織后經(jīng)固定脫水后溶于石蠟，切片脫蠟后用蘇木素和伊紅染色，封片并拍攝。每個樣本組織切片隨機選取10個視野，應用Image J軟件進行測量。

1.4 Western blot blot

取腸系膜動脈充分裂解液，采用BCA測試方法對蛋白濃度進行測定。采用SDS-PAGE電泳對蛋白進行分離，將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，與一抗（抗體α-actin和OPN購自Abcam;抗體GAPDH和calponin購自San?ta Cruz；抗體Akt和p-Akt購自Cell signal）和二抗（均購自Jackson ImmunoResearch）先后結(jié)合，采用ECL發(fā)光試劑反應液與膜上的目的蛋白反應，凝膠成像系統(tǒng)（Bio-rad，ChemiDoc? XRS+System）中進行拍攝。利用Image Lab軟件對拍攝出的條帶影像進行分析。

1.5 實時熒光定量PCRPCR

大鼠腸系膜動脈采用miRcute miRNA提取分離試劑盒（TIANGEN，DP501），按照說明書步驟進行操作，并運用酶標儀對總RNA的純度和濃度進行檢測。反轉(zhuǎn)錄采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（Thermo Scientific，K1622），按照說明書步驟進行操作。mRNA采用通用引物，miRNA及其對應的內(nèi)參U6應用特異性莖環(huán)引物（miR-145：5’-GTCGTATC?CAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATA?CGAAGGGATTC-3’；miR-143：5’-GTCGTATCCAGTG?CAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGATGAG?CTAC-3’；U6：5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’）進行反轉(zhuǎn)錄反應。cDNA擴增采用Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（Applied biosystems，4367218）進行反應，按照說明書步驟進行操作。胰島素樣生長因子I受體（insulin-like growth factor I re?ceptor，IGF-1R）擴增引物為：5’-GATGGAGGAGGTGA?CAGGAA-3’和5’-GTGGAGGTGAAACGGAGAAC-3’；胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS-1）擴增引物為：5’-AGGCACCATCTCAACAATC-3’和5’-GTTTCCCACCCACCATACTG-3’；p70核蛋白體S6激酶（p70 ribosomal S6 kinase，p70S6K）擴增引物為：5’-GGTGGAGTCTGGGAGCATTA-3’和 5’-TGTGAGG?TAGGGAGGCAAAT-3’；GAPDH 擴增引物為：5’-TCCTGCACCACCAACTGCTTAG-3’和 5’-GAT?GACCTTGCCCACAGCCTTG-3’。miR-145擴增引物為：5’-GACCAGTCCAGTTTTCCCAG-3’和 5’-TCG?TATCCAGTGCAGGGTC-3’；miR-143擴增引物為：5’-ACGAGATGAGATGAAGCACT-3’和 5’-TCGTATC?CAGTGCAGGGTC-3’；U6擴增引物為：5’-CTC?GCTTCGGCAGCACATATACT-3’和5’-ACGCTTCAC?GAATTTGCGTGTC-3’。反應結(jié)束后導出數(shù)據(jù)，獲得Ct值，計算△△Ct=（Ct實驗組待測基因－Ct實驗組參照基因）－（Ct對照組待測基因－Ct對照組參照基因），目的基因的相對表達量為2-△△Ct。

1.6 VSMCVSMC培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

采用酶分離法分離雄性Wistar大鼠（8～12周齡）腸系膜動脈VSMC，方法參照文獻[15]。將原代VSMC用含有10%胎牛血清和1%雙抗（penicillin/streptomycin）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中。當培養(yǎng)皿中VSMC密度達80%～90%時用胰酶（0.25%Trypsin-EDTA）進行消化并傳代，VSMC至4～7代且細胞密度達60%～80%時分別進行轉(zhuǎn)染。采用Lipofectamine RNAiMAX 試劑（Invitrogen）將各miRNA干擾序列轉(zhuǎn)染進入細胞內(nèi)：miR-145 mimic組，miR-145 inhibitor組，空脂質(zhì)體negative control（NC）組。miR-145 mimic（雙鏈）序列為5’-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3’和 5’-GGAUUCCUGGGAAAACUGGACUU-3’；miR-145 inhibitor（單鏈）序列為5’-AGGGAUUCCUGGGAAAACUGGAC-3’。 蛋白指標于轉(zhuǎn)染后24 h，48 h，72 h和 96 h進行檢測，各mRNA于轉(zhuǎn)染后12 h、24 h、48 h和72 h進行定量。

1.7 VSMCVSMC免疫熒光染色與激光共聚焦成像

吸走培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，VSMC于4%多聚甲醛中固定，用0.2%Triton X-100孵育細胞進行細胞膜穿孔，PBS漂洗后用5%BSA對非特異性結(jié)合抗體部位進行封閉。以PBS稀釋一抗actin（1︰200），對細胞進行4℃孵育過夜，用PBS漂洗后以PBS稀釋二抗（1︰1000）對細胞進行孵育，PBS漂洗后滴加封片劑以蓋玻片封片。24 h內(nèi)運用激光共聚焦成像系統(tǒng)進行信號捕捉與成像。

1.8 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)輸入及計算采用SPSS16.0軟件。得到的實驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差表示；在體實驗組間比較采用單因素方差分析，各組間多重比較采用Tukey檢驗，干預前后各組血壓數(shù)據(jù)比較采用配對樣本t檢驗；離體實驗對觀測點的多重比較采用LSD方法分析。顯著性檢驗水平以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 運動干預前后大鼠血壓和心率的變化

干預后，WKY-E組大鼠SBP顯著小于WKY-C組（P＜0.05）；SHR-E組SBP非常顯著小于SHR-C組（P＜0.01）；SHR-E組SBP與8周運動前比也顯著下降（P＜0.05）；SHR-E組DBP和MAP也顯著低于SHR-C組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血壓和心率比較（n=20）

2.2 運動干預后大鼠腸系膜動脈形態(tài)學變化

WKY-E組與WKY-C組大鼠腸系膜動脈內(nèi)徑間無顯著差異，SHR-E組動脈內(nèi)徑與SHR-C組相比有升高的趨勢但無顯著差異；WKY-E組與WKY-C組動脈壁厚無顯著差異，SHR-E組動脈壁厚顯著小于SHR-C組（P＜0.05）；動脈壁厚/內(nèi)徑比值，雖然SHR-E組相比SHR-C組下降但未見顯著差異。見圖1。

圖1 運動對腸系膜動脈形態(tài)的影響（n=6）

2.3 運動干預后大鼠腸系膜動脈VSMCVSMC表型標志蛋白的變化

α-actin在WKY-C組和WKY-E組間無顯著差異，SHR-C組α-actin表達顯著低于WKY-C組，而SHR-E組α-actin表達與SHR-C比雖然有所升高但未見顯著性差異（圖2A）。WKY-E組calponin表達與WKY-C比未見顯著性差異，SHR-C組與WKY-C組比其calponin表達顯著降低，SHR-E組calponin表達顯著高于SHRC組（P＜0.05）（圖2B）。WKY-C組和WKY-E組OPN呈現(xiàn)低表達且兩組間未見顯著性差異，SHR-C組OPN表達顯著高于WKY-C組，SHR-E組OPN顯著低于SHRC組（P＜0.05）（圖2C）。

圖2 運動對平滑肌表型標志蛋白的影響（n=12）

2.4 運動干預后大鼠腸系膜動脈miR-miR-143143和miR-miR-145145表達的變化

WKY-C組和WKY-E組miR-145表達無顯著差異，SHR-C組miR-145表達顯著低于WKY-C組（P＜0.01），SHR-E組miR-145表達顯著高于SHR-C組（P＜0.01）。miR-143在WKY-C和WKY-E間也未見顯著差異，SHR-C組miR-143表達顯著低于WKY-C組（P＜0.01）。見圖3。

圖3 運動對腸系膜動脈miR-145和miR-143表達的影響（n=12）

2.5 運動干預后大鼠腸系膜動脈AktAkt信號通路的激活

SHR-C組Akt磷酸化程度較WKY-C被顯著抑制（P＜0.01），SHR-E組Akt信號活性增強，與SHR-C比有顯著性差異（P＜0.05）（圖4）。

2.6 運動干預后VSMCVSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染后α -actinactin表達的變化

與原代分離VSMC相比，經(jīng)過傳代后的VSMC內(nèi)α-actin表達減少且呈現(xiàn)的絲狀結(jié)構(gòu)也減少，細胞呈多邊形；VSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-145 mimic后，miR-145過表達使VSMC中α-actin表達明顯增多且細胞呈梭形，甚至出現(xiàn)了α-actin的絲狀結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)在其收縮功能結(jié)構(gòu)在形態(tài)上增強；VSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-145 inhibitor后VSMC依然保持較低的α-actin表達量，細胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)不明顯，沒有明顯細胞骨架結(jié)構(gòu)（圖5A）。

VSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-145 mimic后收縮表型標志蛋白α-actin在12 h顯著增加（P＜0.01），在24 h達到峰值，與NC組比有非常顯著性差異（P＜0.01），在48 h后恢復正常水平；VSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-145 inhibitor后αactin表達在24 h顯著降低（P＜0.01）后逐漸恢復。VSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染干擾miR-145表達后，其收縮表型標志蛋白α-actin表達均有明顯地改變（圖5B）。

圖4 運動對腸系膜動脈Akt磷酸化的影響（n=12）

圖5 VSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染后α-actin的相對表達情況（n=3）

2.7 VSMCVSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染后AktAkt磷酸化表達變化

VSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-145 mimic使之過表達后顯著抑制了Akt磷酸化（P＜0.01），使Akt在12 h即非常顯著降低，在24 h達到最低值后抑制效果持續(xù)至48 h，在72 h Akt磷酸化程度恢復正常；VSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-145 inhibitor后，Akt受miR-145的抑制效果被顯著解除，Akt活性在轉(zhuǎn)染后12 h顯著升高（P＜0.05），持續(xù)到48 h其活性出現(xiàn)峰值后到72 h恢復正常水平。VSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染干擾miR-145后，Akt活性具有顯著性變化，miR-145與Akt呈明顯的負向調(diào)控關(guān)系（圖6A）。

2.8 VSMCVSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染后AktAkt下游分子 mRNAmRNA表達變化

VSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-145 mimic后miR-145的過表達顯著抑制了IGF-1R mRNA的含量，在12 h出現(xiàn)最低值后逐漸恢復，在48 h依然顯著低于正常水平（P＜0.01）；IRS-1 mRNA表達在12 h受抑制顯著降低（P＜0.01），后逐漸恢復，在24 h達到正常水平；而p70S6KmRNA在48h出現(xiàn)顯著下降并與NC比有非常顯著差異（P＜0.01），后恢復正常水平（圖6B、C、D）。

VSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-145 inhibitor后，IGF-1R mRNA表達在24 h顯著升高（P＜0.01），IRS-1 mRNA表達顯著升高（P＜0.01），在24h顯著高于NC并在72h達到峰值，p70S6KmRNA表達在72 h內(nèi)未出現(xiàn)顯著改變（圖6）。

圖6 VSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染后Akt磷酸化及其下游信號分子mRNA表達情況（n=3）

3 討論

3.1 運動對血壓和小動脈血管形態(tài)的影響

中低強度長期有氧運動常作為干預高血壓的方法，其有效性、安全性、低成本和可實施性在研究和實際運動中也最為廣泛。本實驗采用8周中等強度跑臺訓練對正常大鼠和高血壓大鼠進行運動干預并觀察其血壓變化，結(jié)果顯示運動干預組大鼠與運動前比SBP顯著下降，與安靜組比SBP、DBP和MAP均下降，即該有氧運動可以顯著緩解SHR的高血壓癥狀。

小動脈的重構(gòu)在運動干預高血壓中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用，長期運動后小動脈形態(tài)通過一系列適應性變化降低了外周阻力并增加了血管的反應性而最終起到降低血壓的作用。本研究選取大鼠腸系膜動脈為組織材料進行研究，因其為小動脈肌性阻力血管，中膜平滑肌細胞豐富，符合本研究的實驗目的。本結(jié)果中高血壓運動組大鼠腸系膜動脈形態(tài)未出現(xiàn)明顯適應性變化，其中動脈內(nèi)徑有所增大但并不顯著，壁厚顯著下降，動脈壁厚與內(nèi)徑的比值也未有顯著差異，說明本實驗中有氧運動可以使小動脈形態(tài)發(fā)生改變但并不顯著。以往研究中，高血壓動物模型經(jīng)過長期運動后動脈血管形態(tài)有明顯改變或血管并未發(fā)生重構(gòu)均有報道[13]，其原因可能為：運動所致的血管形態(tài)變化是一個循序漸進積累的過程，細胞功能的改變可能早于血管的整體形態(tài)；研究表明，運動可有效改變腸系膜動脈的收縮功能[16，17]。另外，由于腸系膜動脈由腹腔動脈分支后繼續(xù)分支為各級動脈，這一因素使樣本取材過程中存在一定的誤差，這也是導致各研究結(jié)果差異的原因。盡管大部分研究支持運動員動脈血管內(nèi)徑與缺少體力活動的人有差異[18，19]，然而不同的運動模式（如耐力運動、力量練習或兩者結(jié)合鍛煉）是否會影響動脈的形態(tài)變化尚不清楚，這可能是由于不同的動脈血管檢測部位及不同的運動模式造成的。各級血管對于長期運動的適應性重構(gòu)具有較大差異；并且，血管重構(gòu)更易發(fā)生于外周小動脈及常暴露于血流和剪切力變化的血管中。

3.2 運動對小動脈VSMCVSMC表型轉(zhuǎn)換的影響

機體各級動脈的結(jié)構(gòu)特性相差很大，中小動脈為肌性動脈，管壁內(nèi)彈性膠原逐漸減少而VSMC較多，細胞外基質(zhì)相對較少，發(fā)揮了控制血壓和調(diào)節(jié)血液分配的作用。小動脈因體內(nèi)外因素發(fā)生重構(gòu)的過程中，VSMC形態(tài)和功能的變化（如表型轉(zhuǎn)換）對血壓的調(diào)節(jié)可能發(fā)揮了重要作用。本研究顯示，運動對正常血壓大鼠腸系膜動脈VSMC表型未見顯著性影響，正常和高血壓大鼠動脈中VSMC表型有顯著差異，而運動可以有效調(diào)節(jié)VSMC表型，促進SHR大鼠動脈VSMC維持收縮表型。查閱文獻發(fā)現(xiàn)，運動調(diào)節(jié)高血壓小動脈VSMC表型尚未見報道；在相關(guān)心血管病癥的運動干預后，運動確實調(diào)節(jié)了動脈VSMC表型。Jordao等研究發(fā)現(xiàn)，12周低強度跑臺訓練可以使SHR胸主動脈I型和III型膠原纖維mRNA表達降低，防止血管內(nèi)彈性膜破裂；運動還使大動脈的形態(tài)、α-actin、彈性蛋白和膠原蛋白mRNA表達趨于正常，使VSMC在血管中定向分布[4]。Wamhoff等[5]對雌性小型豬進行16周遞增跑臺實驗，發(fā)現(xiàn)長期的有氧運動可以減弱有絲分裂原引起的冠狀動脈VSMC表型轉(zhuǎn)換即保持具有維持血管收縮功能的收縮表型。Simmons等[20]對高膽固醇血癥的豬實驗模型進行16～20周的中等強度有氧訓練，其通過對Akt、HSP90、Catalase等進行蛋白含量檢測結(jié)合判斷VSMC表型，發(fā)現(xiàn)其冠狀動脈中VSMC表型未見顯著性改變。Bowles等[21]證明運動可以改善冠狀動脈VSMC中鈣離子依賴的基因轉(zhuǎn)錄并激活細胞膜鉀離子通路，維持VSMC穩(wěn)定的收縮表型。以上結(jié)果的差異可能是由于所選擇的判定蛋白的不同所導致的；另外，不同動物模型及干預方式不具備可比性且檢測血管部位的不同都是造成結(jié)果差異的因素。綜上所述，運動對高血壓小動脈VSMC表型具有調(diào)節(jié)作用，維持其具有功能性的收縮表型。

3.3 運動干預VSMCVSMC表型中miR-miR-145145對AktAkt信號通路的調(diào)控關(guān)系

miRNA已在高血壓和VSMC表型間建立了聯(lián)系，但文獻中對于miRNA在運動調(diào)節(jié)高血壓血管功能中的作用鮮有報道，運動對VSMC表型轉(zhuǎn)換中關(guān)鍵miR?NA的影響尚屬空白。miR-143和miR-145作用共享一個初始轉(zhuǎn)錄本，發(fā)揮類似的作用，故許多研究中也把兩者miR-143/145放在一起討論。動物和離體實驗均證明miR-143/145可以使VSMC維持收縮表型，促進其分化并抑制其增殖[22，23]。本研究顯示，運動可以改變高血壓大鼠腸系膜動脈中miR-145的表達并促進其增加，而miR-143表達未明顯受到運動的影響，miR-145對于運動的適應性表達變化可能比miR-143更加靈敏。運動后miR-145表達的升高與小動脈中VSMC收縮表型標志蛋白的升高一致，說明運動引起的miR-145的改變可能參與了VSMC收縮表型的維持。以往研究也顯示，miR-143在調(diào)節(jié)VSMC表型轉(zhuǎn)換中的作用不如miR-145明顯，主要表現(xiàn)為miR-143基因敲除小鼠較miR143/145及miR-145基因敲除小鼠血管結(jié)構(gòu)和收縮功能改變并不明顯[24，25]；另外，miR-145在誘導多能干細胞向VSMC分化過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，而miR-143并沒有明顯作用[26]。

Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡；Akt位于PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路的樞紐部位，是該通路下游的一種重要效應分子。大量研究已證明，VSMC在保持分化狀態(tài)即維持其收縮表型中依賴于Akt通路，且其絲氨酸473位點（Ser 473）磷酸化程度決定了其激活狀態(tài)并與VSMC分化標志蛋白成正相關(guān)[9]；高血壓動物實驗中也證明Akt信號的激活可以使VSMC保持分化，即維持VSMC的收縮表型[27]。在Akt信號通路的上下游存在著反饋調(diào)節(jié)，如在胰島素敏感的組織中（如骨骼肌和脂肪細胞），Akt下游mTOR和p70S6K可以通過抑制Akt上游IRS-1磷酸化來對該通路進行反饋調(diào)節(jié)[28，29]，用雷帕霉素抑制mTOR和p70S6K的表達可以釋放其對IRS-1的抑制從而激活Akt信號，這樣的調(diào)節(jié)機制在糖尿病患胰島素抵抗[30]和VSMC表型轉(zhuǎn)換[31]中都得到了證實。長期運動影響血管中Akt表達在文獻中只有少量報道，Li等[32]發(fā)現(xiàn)12周抗阻訓練可以激活大鼠主動脈中Akt信號的活性，起到對抗氧化應激和保持血管的作用；Wang等[33]在心肌缺血所致的外周血管阻力增大模型中發(fā)現(xiàn)，8周跑臺運動可以使大鼠腸系膜動脈中PI3K、Akt等信號激活，使該通路活性趨于正常。然而，Akt在長期有氧運動后對小動脈VSMC的作用尚未見報道。本研究顯示，高血壓大鼠腸系膜動脈中Akt信號活性被明顯抑制，而運動可以激活動脈中Akt信號的活性，高血壓小動脈中Akt信號在運動后被激活與VSMC收縮表型的維持和miR-145表達的提高相一致。然而，在癌癥腫瘤相關(guān)研究中，miR-145與Akt信號通路存在負調(diào)控關(guān)系[34-36]，故在各組織中miR-145與Akt信號通路可能形成網(wǎng)絡式調(diào)節(jié)來發(fā)揮重要的生理與病理功能。

在心血管疾病中，miR-143/145對VSMC表型及Akt的研究只有個別報道，如Riches等離體培養(yǎng)VSMC發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pre-miR-143/145可以使Akt上游IGF-1R蛋白表達增加，然而抑制miR-143/145并不會使IGF-1R減少[8]，推測miR-143/145對IGF-1R的影響可能受到其它反饋調(diào)節(jié)的控制。在不同病理情況下的病理組織中（如癌癥高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病等），miR-143/145可能呈現(xiàn)截然不同的表達及調(diào)節(jié)機制。在VSMC中miR-143/145與Akt信號間尚未明確建立調(diào)節(jié)關(guān)系，由于miRNA的多靶點效應和Akt信號通路的網(wǎng)絡式反饋調(diào)節(jié)使得兩者在VSMC生理和病理過程中的相互作用更為復雜；miR-143/145可能同時作用于Akt上下游信號分子的mRNA，而Akt信號的一個效應分子的激活或抑制可能被其它效應分子的作用所掩蓋或代償。

故本研究選擇在離體培養(yǎng)的VSMC中對miR-145進行干擾，明確其與Akt信號的調(diào)節(jié)關(guān)系。轉(zhuǎn)染miR-145 mimic使miR-145在增殖至4～7代的VSMC中過表達，VSMC中收縮表型標志蛋白表達增加而合成表型標志蛋白表達減少，且轉(zhuǎn)染后的細胞呈梭形；而轉(zhuǎn)染miR-145 inhibitor后VSMC中α-actin表達減少，VSMC向合成形態(tài)轉(zhuǎn)換。α-actin作為重要的VSMC表型標志蛋白和細胞骨架功能蛋白，其高表達對于肌細胞保持收縮能力是必須的；Xin等[24]證明，敲除Dicer的小鼠由于全身性缺乏mRNA使其VSMC中actin整體骨架蛋白嚴重受損，而miR-145在小鼠內(nèi)過表達后可以明顯緩解其VSMC中骨架蛋白的受損，這個過程與miR-145參與actin的動態(tài)調(diào)節(jié)密切相關(guān)。

本研究結(jié)果還顯示，在VSMC中miR-145過表達分別抑制了IGF-1R和IRS-1 mRNA，同時Akt磷酸化程度降低；當VSMC中miR-145表達減少時，IGF-1R和IRS-1 mRNA的抑制作用解除并出現(xiàn)高表達，同時Akt活性也被激活。說明miR-145可分別靶向于Akt信號通路上游IGF-1R和IRS-1 mRNA，通過抑制其表達進一步抑制Akt信號的激活；然而，運動干預后高血壓動脈VSMC中miR-145和Akt均被激活，推測運動后miR-145維持VSMC的收縮表型可能并不經(jīng)過Akt通路的激活。另外，研究證實Akt在調(diào)節(jié)VSMC表型的過程中其上下游間存在著反饋調(diào)節(jié)的關(guān)系，即Akt上游IGF-1R和IRS-1被磷酸化激活后可以使Akt活性增強進而激活mTOR/p70S6K，然而p70S6K的過度活化可以反過來抑制IGF-1R和IRS-1信號向下轉(zhuǎn)導，故而形成一個反饋環(huán)[31]。在有限的VMSC相關(guān)研究中，Riches等對從二型糖尿病患者隱靜脈分離的VSMC進行培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pre-miR-145可以使IGF-1R蛋白表達增加，然而抑制miR-145并不會使IGF-1R減少[8]。人主動脈平滑肌細胞株研究中，Akt通路的阻斷劑并不能減輕牽張力所致的miR-145抑制，即牽張力并不通過Akt通路發(fā)揮其對miRNA的抑制作用[23]。結(jié)合本研究結(jié)果及以往研究報道中miR-145對Akt通路的靶向關(guān)系可以推測，miR-145與Akt通路的相互關(guān)系可能受到復雜反饋調(diào)節(jié)的控制。在不同的體內(nèi)外因素刺激下（如高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病、運動等），二者可能呈現(xiàn)截然不同的表達及調(diào)節(jié)機制，此方面的研究需要進一步探索。

4 結(jié)論

運動改善高血壓大鼠血壓癥狀的同時使小動脈結(jié)構(gòu)適應性變化；運動有助于維持小動脈中VSMC收縮表型。miR-143/145可能參與了運動導致的VSMC表型適應性變化。miR-145對Akt呈負向調(diào)節(jié)，可能參與了VSMC表型轉(zhuǎn)換過程中Akt信號通路的反饋調(diào)節(jié)。運動后Akt的激活并不是miR-145過表達導致的，提示運動可能通過其它途徑激活Akt信號并促進VSMC向收縮表型轉(zhuǎn)換。