王倩 張珊 牛燕媚 傅力

1天津醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)與病理生理學(xué)系（天津 300070）

2天津醫(yī)科大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)系（天津 300070）

近些年來(lái)，高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)（high intensity inter?val training，HIIT）以其耗時(shí)短、強(qiáng)度大、恢復(fù)快的特點(diǎn)，逐漸受到運(yùn)動(dòng)員和健身愛(ài)好者的青睞。HIIT通過(guò)快速提高運(yùn)動(dòng)者心率、增加身體氧耗，同時(shí)制造缺氧狀態(tài)，使機(jī)體在恢復(fù)期仍需要更多的氧氣，進(jìn)而消耗額外的熱量。也正因如此，針對(duì) HIIT的研究多集中在呼吸、循環(huán)系統(tǒng)相關(guān)臨床表現(xiàn)上，而對(duì)機(jī)體代謝表型及其相關(guān)信號(hào)分子通路研究較少。脂聯(lián)素（Adiponectin，Acrp30）作為脂肪細(xì)胞分泌的特異性因子，能夠經(jīng)血液循環(huán)作用于機(jī)體多個(gè)組織細(xì)胞的特異性受體，增加細(xì)胞葡萄糖攝取和脂肪酸氧化，從而增強(qiáng)細(xì)胞胰島素信號(hào)通路敏感性和細(xì)胞糖、脂代謝。Acrp30在機(jī)體內(nèi)存在兩個(gè)特異性受體——脂聯(lián)素受體1/2（Adiponec?tin receptor 1，AdipoR1/2），全長(zhǎng)Acrp30蛋白被裂解后釋放出的球狀域— gAcrp30對(duì)骨骼肌高表達(dá)的 Adi?poR1顯示出更高的親和力[1]。已有大量研究表明，gAcrp30能夠增加骨骼肌組織的葡萄糖攝取[2]。HIIT顯著的減脂效應(yīng)使得人們開(kāi)始揣測(cè)其在降低脂肪組織體積的情況下，對(duì)諸如 Acrp30等有益脂肪因子的影響。大多數(shù)研究顯示，HIIT顯著減脂的同時(shí)，能夠增加Acrp30的表達(dá)。但也有部分研究結(jié)果與其相反[3,4]，其差異可能與HIIT運(yùn)動(dòng)方案、受試者基礎(chǔ)健康狀況以及所檢測(cè)Acrp30的形式有關(guān)。細(xì)胞自噬因其廣泛參與機(jī)體的各種病理生理過(guò)程，成為目前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。自噬是為機(jī)體提供燃料的生理途徑，在 HIIT造成的細(xì)胞能量迅速消耗狀態(tài)下，骨骼肌細(xì)胞自噬應(yīng)對(duì)能源物質(zhì)急速耗竭的反應(yīng)如何目前尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)比中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)（moderate intensity continuous training，MICT）與HIIT兩種不同運(yùn)動(dòng)形式對(duì)小鼠體成分、血清gAcrp30水平等代謝表型以及骨骼肌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的作用，從而為HIIT防治胰島素抵抗等代謝性疾病提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

4周齡C57BL/6雄性小鼠36只（體重15.00±0.32 g），飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為安靜對(duì)照組（Control組）、中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)組（Moderate Intensity Continuous Training，MICT組）和高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)組（High Intensity Interval Training，HIIT組），每組各12只。均給予12小時(shí)光照。均采用正常飲食喂養(yǎng)，飼料為1022配合維持飼料（常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分：水分≤8.0%，粗蛋白≥18.0%，粗纖維≤5.0% ，粗脂肪≥4.0%）。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，運(yùn)動(dòng)干預(yù) 6周。MICT組為12 m/min（75%VO2max）強(qiáng)度的持續(xù)跑臺(tái)訓(xùn)練，60分/次，1 次/天，5 次/周,共持續(xù) 6 周；HIIT 組為 20 m/min（85%VO2max）持續(xù)1分鐘與8 m/min（50%VO2max）持續(xù)1分鐘的運(yùn)動(dòng)交替進(jìn)行12個(gè)循環(huán)，1次/天，5次/周，共持續(xù)6周（參照 Fernando等制定的跑速與最大攝氧量對(duì)應(yīng)表）[5]。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 體成分檢測(cè)

各組小鼠在6周運(yùn)動(dòng)結(jié)束24小時(shí)后，應(yīng)用Impedi-VET進(jìn)行體成分分析，實(shí)驗(yàn)完成后，ImpediVET軟件生成綜合報(bào)告，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，輸出體重、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、總體液量和脂肪含量等數(shù)據(jù)。最后將所有小鼠采用頸椎脫臼法處死，采用小動(dòng)物手術(shù)器械分離完整股四頭肌，迅速將其放入液氮（－196℃）中速凍，隨后轉(zhuǎn)入－80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 血清ggAAccrrpp3300檢測(cè)

各組動(dòng)物運(yùn)動(dòng)結(jié)束48小時(shí)后，留取血樣（眼內(nèi)眥采血法），靜置30分鐘后，4oC 離心（3000 rpm，15分鐘），提取上清液，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）對(duì)血清gAcrp30水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3檸檬酸合酶（Citrate synthhaassee，CCSS）活性檢測(cè)

檸檬酸合酶（Citrate synthase，CS）能夠催化來(lái)自糖酵解或者其他異化反應(yīng)的乙酰輔酶A與草酰乙酸縮合成檸檬酸，控制三羧酸循環(huán)的入口，是肝臟和骨骼肌等組織細(xì)胞三羧酸循環(huán)過(guò)程的限速酶。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)運(yùn)動(dòng)干預(yù)后小鼠股四頭肌組織CS活性，在組織層面確認(rèn)運(yùn)動(dòng)干預(yù)的效果。檢測(cè)步驟依據(jù)文獻(xiàn)所述[6]。

1.3.4 Western BBlloott檢測(cè)ppAAMMPPKK α--TThhrr117722、LLCC 33Ⅱ//Ⅰ、pp 6622、Beecclliinn 11蛋白表達(dá)

NP-40法提取股四頭肌組織蛋白（裂解液：1%NP-40+EDTA 15 mM（pH 8.0）+NaCl 150 mM+Tris 50 mM），充分混勻；離心后取上清。制備5%積層膠，根據(jù)目的蛋白分子量，制備不同濃度分離膠，將等量總蛋白加入樣品孔，隨后加入電泳緩沖液，于凝膠電泳緩沖液（pH 7.6）內(nèi)電泳2小時(shí)（電壓：60 V轉(zhuǎn)110 V）。采用濕法電轉(zhuǎn)印法，轉(zhuǎn)膜2小時(shí)（電流：300 mA）。根據(jù)預(yù)染蛋白Marker轉(zhuǎn)移情況，判斷蛋白轉(zhuǎn)移情況。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，5% 脫脂牛奶封閉1小時(shí)。在封閉過(guò)的膜上，分別孵育pAMPKα-Thr172、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、Beclin1和 β-tubulin一抗（抗體稀釋比例見(jiàn)表1），TBST洗膜（10分鐘 × 3次），二抗（1︰20000）室溫孵育1小時(shí)，TBST洗膜（10分鐘×3次），ECL反應(yīng)液做發(fā)光底物，用X光膠片暗室曝光，掃描，應(yīng)用 Image J軟件定量分析結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS（SPSS13.0 for Windows）統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差（±s）。單因素方差分析（Oneway ANOVA）進(jìn)行組間分析。將P＜0.05定為組間顯著差異性標(biāo)準(zhǔn)。

表1 抗體稀釋比例

2 結(jié)果

2.1 體成分分析結(jié)果

6周運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，MICT組小鼠體重（Body Weight）顯著低于Control組（P＜0.05），而HIIT組小鼠體重更加顯著地低于Control組（P＜0.01），同時(shí)也顯著低于MICT組（P＜0.05），結(jié)果提示，MICT和HIIT均能有效控制健康雄性小鼠個(gè)體的體重，但就本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，HIIT在控制體重方面的效應(yīng)要優(yōu)于MICT。6周運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，各組的總體液量（Total body water）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；HIIT組的體質(zhì)指數(shù)（BMI）顯著低于Control組（P＜0.01），而MICT組與Control無(wú)顯著差異；此外，MICT組的體脂含量（Fat Mass）顯著低于Control組（P＜0.05），而HIIT組的脂肪含量與Control相比更具顯著性（P＜0.01），同時(shí)HIIT組的脂肪含量也顯著低于 MICT組（P＜0.05），提示6周HIIT能有效控制運(yùn)動(dòng)組小鼠BMI值和體脂含量（見(jiàn)表2），而6周的MICT未能達(dá)到相同效果。

表2 體成分分析結(jié)果

2.2 不同運(yùn)動(dòng)形式對(duì)小鼠股四頭肌檸檬酸合酶活性的影響

各組小鼠股四頭肌CS活性檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，6周MICT后小鼠股四頭肌組織CS活性呈現(xiàn)出高于對(duì)照組的趨勢(shì)，但不具有顯著性效果（P＞0.05）。而6周HIIT后小鼠股四頭肌組織CS活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），表明 HIIT干預(yù)增加骨骼肌細(xì)胞代謝、增加機(jī)體能量消耗，可能是HIIT顯著降低小鼠體重、BMI和體脂含量的原因之一。

2.3 不同運(yùn)動(dòng)形式對(duì)小鼠血清球形脂聯(lián)素水平的影響

如圖2所示，HIIT組的血清gAcrp30水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），而MICT組僅表現(xiàn)出輕微上升，但不具顯著性（P＞0.05）；提示與傳統(tǒng)MICT運(yùn)動(dòng)方式相比，6周 HIIT能夠顯著增加小鼠血清gAcrp30水平。

圖1 各組小鼠股四頭肌檸檬酸合酶活性比較

圖2 各組小鼠血清球形脂聯(lián)素濃度比較

2.4 不同運(yùn)動(dòng)形式對(duì)小鼠骨骼肌組織自噬相關(guān)蛋白的影響

對(duì)小鼠股四頭肌組織中自噬相關(guān)蛋白進(jìn)行定量分析的結(jié)果如圖3所示，MICT組和HIIT組小鼠骨骼肌組織AMPK-Thr172位點(diǎn)的磷酸化水平均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），只有 HIIT 組中自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1的表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01），p62表達(dá)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），而MICT組中LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1及p62的表達(dá)與對(duì)照組相比則沒(méi)有顯著變化（P＞0.05），提示HIIT能夠顯著增加小鼠骨骼肌組織AMPK-Thr172位點(diǎn)的磷酸化，增加骨骼肌細(xì)胞自噬。

3 討論

運(yùn)動(dòng)作為一種減脂增肌的有效手段，已得到廣泛應(yīng)用。HIIT作為一種新興的運(yùn)動(dòng)模式，由于其具有耗時(shí)短、能夠迅速達(dá)到最大運(yùn)動(dòng)效率的優(yōu)勢(shì)，因此近些年來(lái)得到了運(yùn)動(dòng)員、教練員和研究人員的廣泛關(guān)注[2,7]。雖然目前對(duì)HIIT尚無(wú)全面的定義，但通常是指短時(shí)間的間歇配合最大或接近于VO2max強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練[8]。HIIT作為一種省時(shí)高效的運(yùn)動(dòng)方式，已有研究證明其在改善心血管系統(tǒng)功能方面的顯著作用[2]，但對(duì)其在機(jī)體內(nèi)分泌代謝方面的影響，及其可能機(jī)制仍有待解決。

圖3 各組小鼠骨骼肌組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的對(duì)比

基于HIIT在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中呈現(xiàn)的顯著效果，針對(duì)HI?IT與傳統(tǒng)MICT優(yōu)越性方面的對(duì)比研究也在不斷拓展，已有大量研究致力于HIIT相比MICT在提高心肺耐力、改善心肺功能方面的突出效應(yīng)[9,10]，近些年來(lái)隨著HIIT在全民健身運(yùn)動(dòng)中的推廣，其在增強(qiáng)心肺代謝功能方面的作用也日漸凸顯。有研究表明，每周3次、持續(xù)3周的高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)，雖然對(duì)腰臀比的影響不明顯，但顯著降低了青少年個(gè)體的體重、BMI和身體脂肪厚度[11]。前期已有研究表明，HIIT的運(yùn)動(dòng)方式結(jié)合地中海飲食能夠顯著改善肥胖患者的體成分和胰島素敏感性[2]，強(qiáng)調(diào)在HIIT過(guò)程中，飲食對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響的重要性。本實(shí)驗(yàn)選用C57BL/6小鼠為研究對(duì)象，排除了基礎(chǔ)健康水平差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。Shing等人也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)4周 HIIT干預(yù)后，受試個(gè)體除VO2max和最大輸出功率顯著增加外，受試者體脂含量也顯著下降，而這些改變并未在中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)組中出現(xiàn)[12]，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。

大多數(shù)的Acrp30以全長(zhǎng)形式存在于血漿中，而球狀片段可能由活化的單核細(xì)胞和/或嗜中性粒細(xì)胞分泌的白細(xì)胞彈性蛋白酶通過(guò)切割產(chǎn)生[13]。有研究顯示，在進(jìn)行了6個(gè)月耐力運(yùn)動(dòng)的正常成人中，盡管胰島素活性顯著提高，但其血漿空腹Acrp30水平并未出現(xiàn)明顯上升[14]，在本實(shí)驗(yàn)中，6周的MICT干預(yù)也未能增加血清gAcrp30的水平，6周的HIIT則顯著增加了小鼠血清gAcrp30水平，降低了體脂含量。近些年來(lái)針對(duì)運(yùn)動(dòng)影響Acrp30的研究眾多，但結(jié)果卻大相徑庭，推測(cè)運(yùn)動(dòng)影響Acrp30水平可能受很多因素的影響，如機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)的適應(yīng)度、體重變化、基礎(chǔ)健康狀態(tài)、年齡、性別、訓(xùn)練強(qiáng)度、訓(xùn)練持續(xù)時(shí)間和訓(xùn)練類(lèi)型等。

已知在營(yíng)養(yǎng)缺乏、免疫應(yīng)答或環(huán)境刺激等條件下，機(jī)體的自噬水平會(huì)增強(qiáng)。為了探究HIIT造成的細(xì)胞能量迅速消耗的狀態(tài)下，骨骼肌細(xì)胞自噬應(yīng)對(duì)“饑餓”的響應(yīng)如何，我們對(duì)小鼠股四頭肌組織自噬相關(guān)蛋白進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示，與安靜對(duì)照組相比，6周的MICT和HIIT均顯著增加了小鼠骨骼肌組織 AMPKThr172位點(diǎn)的磷酸化水平，但只有6周HIIT增加骨骼肌組織自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1的表達(dá)，而p62表達(dá)下降，提示6周HIIT增加了骨骼肌細(xì)胞自噬活性。

4 總結(jié)

本研究通過(guò)對(duì)比高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)和中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)對(duì)C57BL/6小鼠代謝表型的影響，證實(shí)了HIIT在控制體重、降低BMI以及改善體成分等方面的良好效應(yīng)。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)與MICT組小鼠相比，HIIT在增加血清gAcrp30水平方面效果更為顯著，骨骼肌細(xì)胞自噬活性增加更為顯著。后續(xù)研究應(yīng)側(cè)重HIIT應(yīng)用過(guò)程中相關(guān)要素的機(jī)制探討，為今后HIIT在保障安全前提下的廣泛應(yīng)用以最大限度提高運(yùn)動(dòng)效果提供科學(xué)依據(jù)。