趙宏玉，孫婭楠，張根生，喬江濤，張紅城

(1.哈爾濱商業(yè)大學，黑龍江哈爾濱 150010； 2.深圳出入境檢驗檢疫局，廣東深圳 518045；3.中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所，北京 100093)

人類食用蜂蜜的歷史可以追溯到史前時期，主要是用作甜味劑[1-2]。最近有研究表明，蜂蜜具有抗氧化、抗菌、抗炎等多種生物學功能，這些功能的產(chǎn)生來源于其本身的物理化學特性[3]，包括蜂蜜中的糖、礦物質(zhì)、多酚、蛋白質(zhì)、氨基酸及經(jīng)由葡萄糖氧化產(chǎn)生的過氧化氫等[4-5]。多酚具有獨特的可以在相互之間或與其他分子之間形成復合物的能力，其中最主要的特性就是與蛋白質(zhì)親和，這也導致許多可溶或不可溶復合物的形成[6]，而蜂蜜中多酚類化合物是否與蛋白質(zhì)發(fā)生復合尚不明確。

中國是蜂蜜生產(chǎn)大國，蕎麥蜜是我國重要的單花蜜之一，是一種具有獨特麥芽香味的深色蜜。有研究發(fā)現(xiàn)，在不同種類來源的單花蜜中，蕎麥蜜的抗氧化活性和氧自由基吸收能力(ORAC)相對最強[7]，且多酚類物質(zhì)含量十分豐富[8]。本試驗通過探討蕎麥蜜中是否存在多酚-蛋白質(zhì)復合物及與多酚類化合物結(jié)合的蛋白質(zhì)種類，旨在引導人們關(guān)心蛋白質(zhì)和多酚相互作用的重要性及蜂蜜中這種復合物的營養(yǎng)學和生物學功能。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 試驗材料 蕎麥蜜樣品，2016年產(chǎn)自內(nèi)蒙古，存放于4 ℃冰箱中。

1.1.2 試劑 三氯化鋁、碳酸鈉、氫氧化鈉、氯化鈉、三氯乙酸、三氟乙酸、乙腈、丙酮、甲酸等，均為分析純，購自北京化學試劑公司；考馬斯亮藍G-250、碘乙酰胺，購自北京索萊寶科技有限公司；甲醇，購自美國Fisher公司；98%沒食子酸、蕓香苷對照品，購自上海佳和生物科技有限公司；福林-酚試劑，購自北京康為世紀生物科技有限公司；Novex?4-12% Tris-甘氨酸凝膠、2×上樣緩沖液、10×Tris-甘氨酸電泳緩沖液、20～1 200 ku 非預染蛋白marker，購自美國英杰生命技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器與設備 微量移液器，由德國艾本德(上海)國際貿(mào)易有限公司生產(chǎn)；AL204型分析天平，由梅特勒-托利多儀器有限公司生產(chǎn)；Easy-nLC 1000系統(tǒng)耦合Orbitrap Fusion質(zhì)譜儀、Sorvall Biofuge Startos型臺式離心機，由美國賽默飛(中國)有限公司生產(chǎn)；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵，由長城科工貿(mào)有限公司生產(chǎn)；DZF-6090型真空干燥箱，由上海一恒科學儀器有限公司生產(chǎn)；超純水系統(tǒng)，由美國密理博公司生產(chǎn)；KQ-50DB型數(shù)控超聲波清洗器，由昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)；Amicon Ultra 3KD超濾管、PROTEAN等電聚焦電泳儀、Mini-Protein Ⅱ垂直板電泳裝置、電泳圖像掃描儀，由美國Bio-Rad公司生產(chǎn)；XCell SureLock?Mini-Cell蛋白垂直電泳槽，由美國英杰生命技術(shù)有限公司生產(chǎn)；TS-2型脫色搖床，由江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司生產(chǎn)；F-4600熒光分光光度計，由日本日立公司生產(chǎn)；2080TW型LG微波爐，由LG電子(天津)電器有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 多酚與蛋白復合物提取液的制備 在蕎麥蜜加入 2 mol/L NaCl配制成蜂蜜水，經(jīng)3 ku超濾管超濾，于 12 000 r/min 離心15 min，分別得到濾出液、截流液2個組分，置于4 ℃冰箱中保存。

1.2.2 蕎麥蜜中總酚含量的測定 以沒食子酸為對照品，采用福林-西奧卡特(Folin-Ciocalteu)法建立總酚含量的標準曲線；未經(jīng)氯化鈉處理和經(jīng)氯化鈉處理的蜂蜜水均用3 ku超濾管超濾，各取0.2 mL，采用福林-西奧卡特(Folin-Ciocalteu)法測定，以沒食子酸相對含量表示總酚含量，重復3次。

1.2.3 蕎麥蜜提取物中總黃酮含量的測定 以蕓香苷為對照品，采用三氯化鋁(AlCl3)法建立總黃酮的標準曲線；未經(jīng)氯化鈉處理和經(jīng)氯化鈉處理的蜂蜜水均用3 ku超濾管超濾，各取0.2 mL進行測定，用蕓香苷相對含量表示樣品中的總黃酮含量，重復3次。

1.2.4 蕎麥蜜樣品三維(3D)熒光光譜的全波長掃描 將蕎麥蜜配制成蜂蜜水，經(jīng)3 ku超濾管超濾，于12 000 r/min離心15 min，分別得到濾出液、截流液2個組分，用3D熒光光譜測定，測定條件：激發(fā)起始波長200.0 nm、激發(fā)終止波長 700.0 nm、激發(fā)采樣間隔10.0 nm，發(fā)射起始波長210.0 nm、發(fā)射終止波長 710.0 nm、發(fā)射采樣間隔10.0 nm，掃描速度30 000 nm/min，激發(fā)狹縫5.0 nm，發(fā)射狹縫5.0 nm，電壓 400 V，響應值為自動。

1.2.5 非變性凝膠電泳(Native-PAGE)結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測蜂蜜樣品中的蛋白 選取大于3 ku的組分，采用4%～12%Tri-甘氨酸預制凝膠進行電泳，恒壓125 V，電泳時間3 h，上樣量5 μL；用考馬斯亮藍G-250染色，低火微波1 min，再在搖床上染色5 min；用脫洗液脫色至背景干凈、蛋白條帶清晰；取Native-PAGE膠上的條帶進行脫鹽處理用于膠內(nèi)酶解：樣品用25 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)還原二硫鍵，用55 mmol/L碘乙酰胺烷基化，再用測序級改性的胰蛋白酶用50 mmol/L碳酸氫銨于 37 ℃ 處理12 h以達到分離膠消化；所得到的肽段在50%乙腈水溶液中用1%三氟乙酸提取2次，真空離心，蒸發(fā)濃縮器濃縮；將處理好的肽段進行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜條件：100 mm×2 cm、3 μm Acclaim PepMap C18色譜柱分離，以300 nL/min流速運行 60 min 梯度洗脫，流動相A為水并含有0.1%甲酸，流動性B為乙腈并含有0.1%甲酸，350～1 550m/z、分辨率 120 000 進行全掃描；離子阱二級質(zhì)譜掃描，使用自帶的蛋白質(zhì)譜搜庫軟件(Version PD1.4)對UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫進行搜索匹配。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕎麥蜜樣品中的總酚和總黃酮含量

試驗結(jié)果表明，未經(jīng)NaCl處理和經(jīng)NaCl處理蕎麥蜜水溶液的濾出液中總酚和總黃酮含量有一定差異，未經(jīng)NaCl處理的蕎麥蜜總酚、總黃酮含量分別為(1 742.1±63.6)、(23.5±5.3) mg/kg，經(jīng)2 mol/L NaCl處理的蕎麥蜜總酚、總黃酮含量分別為(2 723.8±41.3)、(28.7±6.4) mg/kg，經(jīng) 2 mol/L NaCl處理的蜂蜜水濾出液總酚含量明顯高于未經(jīng)處理的，這可能是由于蜂蜜經(jīng)2 mol/L NaCl水溶液處理后，破壞了蛋白和多酚二者之間的非共價鍵，使復合的多酚游離出來，經(jīng)超濾后多酚與蛋白分離，使得小于3 ku的多酚含量升高；蕎麥蜜經(jīng)NaCl處理前后的樣品總黃酮含量相差很小，為 5.2 mg/kg，說明蜂蜜中主要是多酚和蛋白發(fā)生復合，而不是黃酮。

2.2 蕎麥蜜樣品3D熒光光譜全波長掃描結(jié)果

3D熒光光譜是近些年來在熒光光譜分析基礎上發(fā)展起來的一種熒光分析技術(shù)[9]，與普通的熒光光譜分析方法相比，3D熒光光譜法具有能夠獲得激發(fā)波長λex與發(fā)射波長λem同時變化時的熒光強度信息的優(yōu)點，可以提供在普通發(fā)射譜中得不到的信息[10]，能夠提供熒光強度、熒光偏振等物理參數(shù)，進而了解蛋白質(zhì)分子中熒光生色基團所處的微環(huán)境，有助于闡述蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能[11]，成為研究其他物質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的主要手段[12]。有研究表明，蛋白質(zhì)的激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長為305～354 nm[13]，多酚類物質(zhì)的激發(fā)波長為 330～385 nm，發(fā)射波長為420～485 nm[14]。由圖1可知，未經(jīng)NaCl處理的蕎麥蜜有2個峰，第1個位置為λex=276～283 nm、λem=313～324 nm，表明樣品中存在蛋白成分；第2個位置為λex=335～368 nm、λem=420～464 nm，表明樣品中存在多酚成分。由圖2、圖3可知，NaCl處理的蕎麥蜜經(jīng)超濾后小于3 ku的組分中只有1個峰，λex=353～367 nm、λem=431～468 nm，表明樣品中只存在多酚成分；大于3 ku的組分中有2個峰，對應的λex=347～378 nm、λem=429～476 nm和λex=271～289 nm、λem=305～346 nm，說明該組分中既有多酚類化合物又有蛋白，這是由于游離態(tài)的多酚成分分子量不可能大于3 ku。因此可以推測，組分中大于3 ku的多酚類物質(zhì)是以多酚和蛋白的復合物形式存在的。

2.3 Native-PAGE和LC-MS/MS分析蕎麥蜜中的復合蛋白

2.3.1 Native-PAGE分析 由圖4可知，蜂王漿主蛋白1提取液(F)分別在620、290、66 ku附近有明顯的條帶，處理后大于3 ku的蕎麥蜜超濾液2個重復組分M1、M2在620、290、66 ku附近也有明顯的條帶出現(xiàn)，且條帶位置均略高于F組分，說明蕎麥蜜大于3 ku的組分中可能是蜂王漿主蛋白1，并且是以復合物形式存在的。

2.3.2 LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定結(jié)果 分別選取Native-PAGE電泳中N1～N6膠進行膠內(nèi)酶解，利用LC-MS/MS對其蛋白進行鑒定，以進一步確認蕎麥蜜中與多酚類物質(zhì)復合的蛋白質(zhì)種類。由表1可知，N1組分與蜂王漿主蛋白1(MRJP 1_ApismelliferaL.)的序列覆蓋率為73.15%，鑒定得到的肽段數(shù)為33個；N2組分與MRJP 1_ApismelliferaL.、MRJP 3_ApismelliferaL.的序列覆蓋率分別為75.23%、54.41%，鑒定得到的肽段數(shù)分別為38、27個；N3組分與MRJP 1_ApismelliferaL.、MRJP 2_ApismelliferaL.的序列覆蓋率分別為 86.57%、66.37%，鑒定得到的肽段數(shù)分別為38、25個；N4組分與MRJP 1_ApismelliferaL.、MRJP 2_ApismelliferaL.的序列覆蓋率分別為83.56%、71.02%，鑒定得到的肽段數(shù)為34、29個；N5組分與MRJP 1_ApismelliferaL.、MRJP 2_ApismelliferaL.的序列覆蓋率分別得為55.09%、67.36%，鑒定得到的肽段數(shù)分別為24、27個；N6組分與MRJP 1_ApismelliferaL.的序列覆蓋率為67.70%，鑒定得到的肽段數(shù)為30個。因此推測，蕎麥蜜中的蛋白主要由MRJP 1_ApismelliferaL.、MRJP 2_ApismelliferaL.、MRJP 3_ApismelliferaL.組成的。從生物信息學比對結(jié)果看，確定蕎麥蜜大于3 ku組分中的蛋白為MRJP 1_ApismelliferaL.。

表1 LC-MS/MS鑒定蕎麥蜜中的蛋白種類

3 結(jié)論

通過測定蕎麥蜜中總酚含量、3D熒光光譜及Native-PAGE、LC-MS/MS質(zhì)譜分析，確認蕎麥蜜中存在多酚與蛋白復合物，且多酚類成分是與蜂王漿主蛋白1(MRJP 1_ApismelliferaL.)結(jié)合的，這為蜂蜜中復合物營養(yǎng)學和生物學功能的進一步研究提供了理論參考。