李 爽，李 耕，潘玉洲，張 力，申旭東，李忠紅，鄭文軍，楊文波，袁立來(lái)，姜 濤，楊 健

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院營(yíng)口增殖實(shí)驗(yàn)站，遼寧營(yíng)口 115004； 2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京 100039；3.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心/院長(zhǎng)江中下游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境評(píng)價(jià)與資源養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214081)

耳石是硬骨魚(yú)類內(nèi)耳中的一種硬組織，作為一種生物礦物伴隨著魚(yú)類生長(zhǎng)的同時(shí)，其能以微化學(xué)“指紋”或者微結(jié)構(gòu)特征等形式記錄魚(yú)類生活史過(guò)程中的全部生境履歷信息[1-3]。魚(yú)體生長(zhǎng)環(huán)境的水化學(xué)特征的變化導(dǎo)致耳石組成元素發(fā)生變化，從而形成耳石上的元素環(huán)帶X射線電子探針微區(qū)分析技術(shù)(EPMA)能夠快速分析固相介質(zhì)表面的元素種類及含量，具有測(cè)試精度高、檢測(cè)點(diǎn)密度大、能保持耳石樣品信息完整等優(yōu)點(diǎn)，為相應(yīng)元素的檢測(cè)分析提供技術(shù)保障[4]。由于在不同鹽度水體中魚(yú)類耳石上源自生境的鍶(Sr)元素沉積水平差異明顯，因此利用耳石上Sr含量和Sr/Ca的值等指標(biāo)具有有效推演魚(yú)類生活史、重建水體環(huán)境變化、識(shí)別不同種群的潛力[5-8]。除此之外，利用耳石生長(zhǎng)的一些特性(如從受精卵開(kāi)始耳石即開(kāi)始形成、一旦形成后不會(huì)發(fā)生重吸收現(xiàn)象等)，外源Sr標(biāo)記技術(shù)也日益受到重視。然而，我國(guó)目前海水魚(yú)類耳石外源Sr標(biāo)記技術(shù)尚有待系統(tǒng)研究。

褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)別稱牙片、偏口、比目魚(yú)，是冷水性、底棲的名貴海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，是北方沿海重要的海水增養(yǎng)殖魚(yú)類之一。褐牙鲆個(gè)體大、肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、蛋白質(zhì)含量高、易于消化，是做生魚(yú)片的好材料，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)，市場(chǎng)十分廣闊，經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高。牙鲆曾在我國(guó)的漁業(yè)史上占有重要地位，20世紀(jì)七八十年代褐牙鲆的捕獲量為 2 000 t/年。近二三十年來(lái)，由于過(guò)度捕撈和環(huán)境污染造成自然資源大幅度下降，中國(guó)牙鲆人工繁育的研究開(kāi)始于1959年，20世紀(jì)70年代才進(jìn)入苗種生產(chǎn)研究，1992年以后牙鲆人工養(yǎng)殖發(fā)展迅速，目前山東、遼寧、河北、江蘇、浙江等地都開(kāi)展了牙鲆的人工養(yǎng)殖，除了開(kāi)展網(wǎng)箱養(yǎng)殖和池塘養(yǎng)殖外，正在大力發(fā)展大規(guī)模的工廠化養(yǎng)殖，并取得了很好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益[9]。增殖放流在牙鲆資源的恢復(fù)中起到重要作用，探尋一種高效、穩(wěn)定、安全的標(biāo)記方法顯得尤其重要。本研究嘗試通過(guò)對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)階段添加外源Sr，并利用EPMA檢測(cè)Sr在耳石上的沉積情況，一方面分析外源Sr標(biāo)記技術(shù)在海水魚(yú)放流標(biāo)記工作方面的可行性，另一方面嘗試探討褐牙鲆外源Sr標(biāo)記的最佳標(biāo)記濃度。相關(guān)研究結(jié)果不僅可為拓展海水魚(yú)類耳石外源Sr標(biāo)記技術(shù)提供一個(gè)重要的實(shí)例，同時(shí)也可為褐牙鲆放流標(biāo)記探尋一種更加客觀而有效的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2016年4月本研究在中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院營(yíng)口增殖實(shí)驗(yàn)站望海科研試驗(yàn)基地進(jìn)行，試驗(yàn)魚(yú)為實(shí)驗(yàn)站望海試驗(yàn)基地人工孵化后的仔魚(yú)，培育50 d后再開(kāi)始試驗(yàn)，配置不同外源SrCl2·6H2O(天津市大茂化學(xué)試劑廠)濃度0、8、12、16、20 mg/L 等5組。試驗(yàn)方案是每組2個(gè)平行，共10個(gè)養(yǎng)殖水槽。1號(hào)組對(duì)應(yīng)0，2號(hào)組對(duì)應(yīng)8 mg/L，依次類推至5號(hào)組對(duì)應(yīng)20 mg/L。將提前配置不同外源Sr濃度養(yǎng)殖用水放入對(duì)應(yīng)標(biāo)志的養(yǎng)殖水槽中，并分別放入健康魚(yú)苗30尾。浸染20 d，各組換水2次/d，換入水為對(duì)應(yīng)濃度Sr換水換水量為100%，吸底2次/d，投餌2次/d，餌料為新鮮的鹵蟲(chóng)，20 d后在自然水體中恢復(fù)養(yǎng)殖20 d，操作方法與前期相同，恢復(fù)養(yǎng)殖20 d后每組隨機(jī)取5尾送檢。耳石分析測(cè)試在中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心進(jìn)行。

1.2 樣品采集、處理與分析

采樣后在解剖鏡下將矢耳石取出，清洗后晾干，置于培養(yǎng)板中備用。耳石先包埋，待樹(shù)脂凝固后取出，用AB膠將其粘貼于載玻片上，使用500目砂輪和1 200目砂紙打磨耳石至核心即將暴露后，使用磨拋機(jī)裝備機(jī)拋光，至耳石表面無(wú)明顯劃痕；樣品放入Milli-Q水中超聲清洗5 min后，自然條件下晾干24 h；完全干燥后，使用真空鍍膜機(jī)蒸鍍碳膜。

該研究利用電子微探針?lè)治鰞x進(jìn)行定量線分析和面分布分析。參考Yang等的方法[10-11]，從耳石核心沿耳石最長(zhǎng)徑至邊緣連續(xù)測(cè)定Sr、Ca含量。

數(shù)據(jù)處理利用Excel 2007軟件進(jìn)行線分布分析中的平均值和倍數(shù)計(jì)算以及Sr/Ca的值變化作圖。耳石中的鍶含量遠(yuǎn)小于鈣含量，按慣例Sr/Ca經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化的比值，即(Sr/Ca)×103[11]。

1.3 儀器和設(shè)備

磨拋機(jī)(LaboPol-35，丹麥Struers公司)；真空鍍膜機(jī)(JEE-420，日本電子株式會(huì)社)；電子微探針?lè)治鰞x(JXA-8100型EPMA，日本電子株式會(huì)社)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007軟件進(jìn)行線分布分析中的平均值和倍數(shù)計(jì)算以及Sr/Ca值變化作圖，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行不同階段及與對(duì)照組的Sr/Ca值差異顯著性分析，顯著性水平設(shè)定為0.05。耳石中的鍶含量遠(yuǎn)小于鈣含量，按慣例Sr/Ca經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化的比值，即(Sr/Ca)×103[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源Sr在褐牙鲆耳石上線分析的Sr/Ca值

由圖1和表1可知，空白組即0 mg/L組試驗(yàn)魚(yú)的耳石 Sr/Ca 的值變化不明顯，而8～20 mg/L組試驗(yàn)魚(yú)的耳石 Sr/Ca 的值變化十分明顯，根據(jù)圖2不同色區(qū)的分布可大致將試驗(yàn)魚(yú)的生長(zhǎng)分為3個(gè)色區(qū)階段。8 mg/L組第一階段的色區(qū)為從耳石核心沿矢狀邊緣方向的0～440 μm范圍，Sr/Ca的值與空白組基本一致；第二階段的色區(qū)為從耳石核心沿矢狀邊緣方向的440～870 μm范圍，Sr/Ca的值基本達(dá)到最高；第三階段的色區(qū)從耳石核心沿矢狀邊緣方向的870 μm至耳石最長(zhǎng)軸邊緣，其Sr/Ca的值逐漸降低并逐漸趨向第一階段的Sr/Ca的值。12 mg/L組第一階段的色區(qū)平均為0～350 μm 范圍，Sr/Ca的值與空白組基本一致；第二階段的色區(qū)平均在350～670 μm范圍，Sr/Ca的值基本達(dá)到最高；第三階段的色區(qū)平均為670 μm至耳石最長(zhǎng)軸邊緣，Sr/Ca的值逐漸降低并逐漸趨向第一階段的Sr/Ca的值。16 mg/L組第一階段的色區(qū)平均為0～390 μm范圍，Sr/Ca的值與空白組基本一致；第二階段的色區(qū)平均為390～670 μm范圍，Sr/Ca的值基本達(dá)到最高；第三階段的色區(qū)平均為670 μm至耳石最長(zhǎng)軸邊緣，Sr/Ca的值逐漸降低并逐漸趨向第一階段的色區(qū)。20 mg/L組平均第一階段的色區(qū)平均為0～350 μm范圍，Sr/Ca 的值與空白組基本一致；第二階段的色區(qū)平均為350～720 μm范圍，Sr/Ca的值基本達(dá)到最高；第三階段色區(qū)平均為720 μm至耳石最長(zhǎng)軸邊緣，Sr/Ca的值逐漸降低并逐漸趨向第一階段的Sr/Ca的值。

不同浸染濃度Sr/Ca的值微化學(xué)變化詳細(xì)信息見(jiàn)表1，經(jīng)外源Sr2+干擾后，可將耳石Sr/Ca分為明顯的3個(gè)階段。其中，第一階段的Sr/Ca均值與對(duì)照均無(wú)顯著差異，處理組第二階段的Sr/Ca均值、峰值均顯著高于相應(yīng)的第一階段(P<0.01)，而比值變動(dòng)不大的第一階段與第三階段沒(méi)有顯著性差異，通過(guò)組間比較可以發(fā)現(xiàn)16、20 mg/L的Sr峰比較接近，幾乎無(wú)差異，故利用人工標(biāo)記時(shí)，可適當(dāng)選擇低濃度來(lái)降低標(biāo)記成本。

2.2 外源Sr2+在褐牙鲆耳石上的面分布

由圖2所示，褐牙鲆在不同濃度的Sr2+水體中浸染20 d，再恢復(fù)到自然水體中再養(yǎng)殖20 d，在耳石上能形成極為明顯的紅色“高鍶環(huán)帶”，對(duì)照組無(wú)變化。同時(shí)，“高鍶環(huán)帶”明顯隨著外源水體濃度升高和時(shí)間的推移而“變寬”并且恢復(fù)至正常水體后，鍶環(huán)帶緩慢從紅色經(jīng)黃色向綠色轉(zhuǎn)變，Sr/Ca的值逐漸降低。表明外源8～20 mg/L濃度的SrCl2·6H2O均能在牙鲆耳石上大量沉積，且鍶環(huán)帶顏色與外源鍶濃度呈正相關(guān)，在浸染結(jié)束后仍能持續(xù)向耳石上沉積一段時(shí)間，并可恢復(fù)至初始水平。

表1 褐牙鲆耳石中鍶鈣含量比值的變化

3 討論與結(jié)論

EPMA作為一種有效測(cè)定固相微區(qū)元素成分的技術(shù)，在材料科學(xué)、礦物學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[11-13]。近年來(lái)，隨著對(duì)魚(yú)類耳石的生態(tài)學(xué)意義的不斷研究，耳石微化學(xué)與魚(yú)類生活史信息間的關(guān)系得以論證。因此，EPMA分析技術(shù)也被引入到了魚(yú)類生態(tài)學(xué)研究中，并憑借交叉學(xué)科的優(yōu)勢(shì)使其在海洋[5]、河口[11]、洄游性[10]魚(yú)類的生境履歷反演、產(chǎn)卵場(chǎng)群體的識(shí)別[14-15]以及淡水魚(yú)類[16-17]和洄游性魚(yú)類[18]增殖放流標(biāo)記等方面取得了許多突破性的成果。

通常情況下，魚(yú)類耳石中鍶、鈣含量的比值與水體鹽度具有正相關(guān)性[19]，借此可以通過(guò)分析耳石上Sr/Ca的值來(lái)研究魚(yú)體的生活水環(huán)境鹽度，進(jìn)而反演其生境履歷信息，討論其時(shí)空分布動(dòng)態(tài)以及群體組成情況等。因此，通過(guò)人為控制魚(yú)類的生活水體中的Sr濃度也必然會(huì)在耳石上產(chǎn)生印記，這也得到了本研究結(jié)果的證實(shí)。在20 d浸染試驗(yàn)后，耳石上Sr濃度高峰一直持續(xù)到接近邊緣，再將其恢復(fù)到正常水體養(yǎng)殖20 d后能回到正常水平。從浸染開(kāi)始時(shí)到Sr在褐牙鲆耳石上沉積有延時(shí)過(guò)程，在含有不同濃度的Sr2+水體中侵染20 d，恢復(fù)到正常水體中養(yǎng)殖20 d，而Sr濃度峰區(qū)卻持續(xù)了20 d以上，在正常水體中養(yǎng)殖時(shí)，Sr濃度峰區(qū)依舊存在，仍能持續(xù)向耳石上沉積一段時(shí)間。表明Sr元素從水體到耳石的沉積過(guò)程是循序漸進(jìn)的。姜濤等分析刀鱭(Coilianasus)在快速向淡水洄游后耳石Sr/Ca的值也并不能很快下降至淡水水平[17]。在整個(gè)試驗(yàn)進(jìn)程中，試驗(yàn)魚(yú)都能保持正常生長(zhǎng)、攝食，未產(chǎn)生明顯的應(yīng)激反應(yīng)。王臣等在大麻哈魚(yú)耳石Sr標(biāo)記工作的結(jié)果顯示，即使在50～400 mg/L這樣含量極高的外源Sr條件下，試驗(yàn)魚(yú)依舊未產(chǎn)生明顯的應(yīng)激反應(yīng)或毒性反應(yīng)，并且之后耳石上的Sr含量能恢復(fù)到正常水平[18]，說(shuō)明其急性毒性風(fēng)險(xiǎn)也較小。而Sr本身亦作為生物的必需元素[17]，由此可見(jiàn)本研究所用0～20 mg/L外源Sr(SrCl2·6H2O)進(jìn)行褐牙鲆耳石標(biāo)記工作應(yīng)該是安全、可行的。

外源Sr在褐牙鲆耳石上沉積的特點(diǎn)能很好地吻合對(duì)魚(yú)類放流標(biāo)志的要求，使人工控制外源Sr在耳石上做明顯的“鍶元素標(biāo)記”成為可能。該標(biāo)記方法與其他內(nèi)源性標(biāo)記方法相比操作簡(jiǎn)便，利用精密的EPMA技術(shù)檢測(cè)準(zhǔn)確，從Sr/Ca高峰的出現(xiàn)而言是很穩(wěn)定的，應(yīng)該是我國(guó)牙鲆放流標(biāo)志的新方向。值得注意的是，為今后更好地于褐牙鲆增殖放流標(biāo)記工作中利用該技術(shù)，如何篩選所需標(biāo)記用Sr的最佳劑量、最佳浸染時(shí)間，以及如何去評(píng)估Sr富集對(duì)于牙鲆水產(chǎn)品安全是否會(huì)產(chǎn)生影響等很多問(wèn)題還需要在下一步的研究中得到有針對(duì)性的探討。