豆曉霞，劉 洋，李 敏，荊明龍，李明奇，王小鳳，陳創(chuàng)夫，張 輝

(石河子大學動物科技學院/動物疾病防控兵團重點實驗室，新疆石河子 832000)

由布魯氏菌(Brucella)引起的布魯氏菌病(Brucellosis)是一種重要的人畜共患病，可造成動物流產(chǎn)、死胎，生殖器官不對稱腫大，人類似流感狀的周期性波浪熱，嚴重威脅畜牧業(yè)的發(fā)展和公共衛(wèi)生健康，給世界經(jīng)濟帶來嚴重的損失[1]。布魯氏菌是屬于α-2變形菌家族的致病性革蘭氏陰性菌[2]，胞內(nèi)寄生和復制是布魯氏菌的主要毒力特征[3]。布魯氏菌不僅可以通過消化道黏膜和呼吸道黏膜進入機體內(nèi)，還可以通過皮膚、眼結(jié)膜等進入機體內(nèi)，并被宿主體內(nèi)的吞噬細胞吞噬[4]，雖然布魯氏菌可以在多數(shù)細胞內(nèi)寄生，但是其仍具有宿主特異性，該菌主要寄生在巨噬細胞和胚胎滋養(yǎng)層細胞內(nèi)[5]。布魯氏菌屬經(jīng)典的6個種屬分別為羊種布魯氏菌(B.melitensis)、牛種布魯氏菌(B.abortus)、豬種布魯氏菌(B.suis)、犬種布魯氏菌(B.canis)、綿羊種布魯氏菌(B.ovis)、沙林鼠種布魯氏菌(B.neotomae)[6-8]，分別主要感染山羊和綿羊、牛、豬、狗以及嚙齒類動物。最近又有4種布魯氏菌被鑒定出來，包括從海豹分離的鰭腳類布魯氏菌(B.pinnipediae)，從海豚分離的鯨種布魯氏菌(B.ceti)[9]，從紅狐、田鼠、土壤中分離的田鼠種布魯氏菌(B.microti)[10-12]，從乳腺移植病人分離的湖浪種布魯氏菌(B.inopinata)[13]。盡管犬種布魯氏菌和綿羊種布魯氏菌感染動物，但人感染犬種布魯氏菌很罕見，人感染綿羊種布魯氏菌也未報道[14]，而羊種布魯氏菌和流產(chǎn)布魯氏菌是人感染的主要病原菌。目前，人感染布魯氏菌主要通過已經(jīng)感染的動物(如綿羊，山羊，牛等一些家畜)以及動物肉制品、奶牛津液(如尿液和乳汁)、污染奶制備的奶制品等。人通過污染的環(huán)境(如氣溶膠)以及傷口等途徑也可造成布魯氏菌病的傳染。值得一提的是，人在感染布魯氏菌平均3～4周后，初期會出現(xiàn)波浪熱，尤其是食欲不振、渾身無力、盜汗、體質(zhì)量減輕，偶爾還會出現(xiàn)頭痛，后期會伴發(fā)關節(jié)疼痛等。而初期的癥狀和感冒類似，往往會被誤認為感冒，以至于延誤病情的治療。因此，防控家畜布魯氏菌病的發(fā)生也有利于減少人感染布魯氏菌病的概率。

延伸因子(elongation factors，EF)是在mRNA翻譯時促進多肽鏈延伸的蛋白質(zhì)因子，在原核生物和真核生物中延伸的因子并不相同。原核延伸因子是原核細胞進行翻譯時所需要的3種延伸因子，分別命名為EF-Tu、EF-Ts以及EF-G(其中EF-Tu和EF-Ts可以復合為EF-T)[15]，原核延伸因子的化學本質(zhì)都是蛋白質(zhì)。布氏桿菌是一種胞內(nèi)寄生菌，可在專業(yè)或非專業(yè)吞噬細胞內(nèi)增殖。布氏桿菌在宿主細胞中的存活能力和繁殖能力對其毒力都是至關重要的，而加強病原菌與宿主相互作用分子機制的研究，是預防和控制布魯氏菌感染的前提。最近研究表明，細菌EF-Tu蛋白是一種多功能蛋白，不僅僅是作為蛋白翻譯因子起作用，而且更重要的是EF-Tu參與許多重要的細胞和疾病過程[16]。布氏桿菌EF-Tu在感染宿主細胞中作用的研究目前依然是空白。關于布魯氏菌翻譯延伸因子Tu的研究，僅見布魯氏菌BMEI0742基因編碼的翻譯延伸因子Tu。本研究選取羊布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)蛋白BMEI0742基因為研究對象，并構(gòu)建其原核表達載體，檢測其反應原性，分析其生物學功能，為探討其在布氏桿菌侵入及胞內(nèi)存活過程中的調(diào)控作用及其分子機制等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 羊種布魯氏菌16M株、大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5α菌株、BL21(DE3)菌株、pET-28a載體菌株由石河子大學動物科技學院/動物疾病防控兵團重點實驗室保存；pMD19-T載體購自Promega公司。

1.1.2 試劑 羊種布魯氏菌陽性血清由石河子大學動物科技學院/動物疾病防控兵團重點實驗室保存；誘導劑IPTG購自Merck公司；限制性內(nèi)切酶(BamH Ⅰ/XhoⅠ)、DNA Marker、T4連接酶購自大連寶生物工程有限公司；2×EsTaqMasterMix、細菌質(zhì)粒小提取試劑盒以及瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限責任公司；HRP標記的兔抗羊IgG、蛋白Marker購自北京康為世紀生物科技有限責任公司；2%蛋白質(zhì)印跡(WB)無蛋白封閉液購于生工生物工程(上海)股份有限公司；其他試劑均為實驗室常用分析純度的產(chǎn)品。

1.1.3 儀器 潔凈工作臺(SW-CJ-2FD)；PCR儀(Eppendorf，nexus GSX1)；低溫冷卻液循環(huán)泵(DLSB，5L/S)；超速離心機(Thermo，PIC021)；恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9162)；恒溫振蕩器(CRYSTAL，IS-RSV1)；高速冷凍離心機(ThermoFisher)；超聲波細胞粉碎機(JY，88-IIN)；水浴鍋(XMTD-8222)；聚丙烯酰胺凝膠電泳儀(DYY-8B)；半干式電轉(zhuǎn)儀(BIO-RAD)；蛋白純化儀(AKTA)。

1.2 方法

1.2.1 目的基因擴增 根據(jù)GenBank中登錄的布魯氏菌(NC-003317)BMEI0742基因序列設計引物，由北京六合華大基因有限公司合成，序列見表1。

表1 PCR引物序列

以羊種布魯氏菌16M株的滅活菌液(85 ℃金屬浴滅活 1 h)為模板，進行菌液PCR擴增，PCR反應體系(20 μL)見表2，反應條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 10 s，30個循環(huán)；最后72 ℃ 1 min。反應結(jié)束后，PCR產(chǎn)物 4 ℃ 保存或直接進行1%瓊脂糖凝膠凝膠電泳?；厥漳康幕蚱危⒒厥蘸竽康钠闻cpMD19-T載體在16 ℃水浴條件下進行連接，連接體系(10 μL)見表3，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T-BMEI0742。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，并在氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上進行陽性篩選，進行菌液PCR和雙酶切鑒定陽性克隆，并將提取的質(zhì)粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

表2 PCR反應體系

表3 連接體系

1.2.2 構(gòu)建BMEI0742基因原核表達載體 將送公司測序正確的質(zhì)粒pMD19-T-BMEI0742和pET-28a載體用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ 進行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段和酶切后的線性pET-28a載體。將目的片段和線性pET-28a載體在T4連接酶的作用下16 ℃水浴連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，經(jīng)卡那抗性的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆，進行菌液PCR驗證和酶切鑒定。

1.2.3 重組蛋白表達及表達條件的優(yōu)化 將篩選出的陽性克隆菌在LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min搖床中培養(yǎng)過夜，將培養(yǎng)過夜的菌液按1 ∶100的比例接種至新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)約1 h，使其D600 nm值為 0.4～0.6，在其他條件不變的情況下，按照不同的誘導劑(IPTG)濃度(終濃度為0.2、0.6、1.0 mmol/L)誘導不同時間(0、4、6、8 h)后收集菌體。取1 mL菌液離心后，棄掉上清，并在離心管中按照1 ∶4的比例加入經(jīng)過稀釋的1×SDS蛋白上樣緩沖液，在振蕩器上振蕩使菌體和蛋白上樣液充分混勻，在金屬加熱器上100 ℃加熱10 min，取20 μL樣品進行15%蛋白電泳，觀察電泳結(jié)果。篩選目的基因的最佳表達條件，并以最佳的誘導表達條件進行大量誘導表達，采用AKTA蛋白純化系統(tǒng)純化后進行SDS-PAGE電泳鑒定。

1.2.4 重組蛋白的Western-Blot檢測 篩選出最佳表達條件后，以最佳誘導條件誘導重組蛋白表達，并對該蛋白進行純化，經(jīng)SDS-PAGE后，將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，以200 mA的電流轉(zhuǎn)膜50 min。將膜放入預先用TBST緩沖液洗滌后的雜交瓶中，37 ℃封閉90 min，用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次7 min。加入1 ∶500比例稀釋的、經(jīng)石河子大學動物疾病防控兵團重點實驗室鑒定的羊種布魯氏菌陽性血清，37 ℃孵育2 h，用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次7 min，然后加入 1 ∶5 000 比例稀釋的辣根過氧化氫酶標記的兔抗綿羊IgG，37 ℃孵育1 h，TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次7 min。避光條件下，DAB顯色劑顯色后拍照。

1.3 重組蛋白的生物信息學分析

1.3.1 跨膜結(jié)構(gòu)分析 通過TMHMM Server v.2.0在線軟件分析(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)羊種布魯氏菌的BMEI0742蛋白氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)。

1.3.2 信號肽分析 利用SignalP 4.1 Server在線軟件預測(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)羊種布魯氏菌的BMEI0742蛋白的信號肽。

1.3.3 抗原決定簇的預測 利用Predicting Antigenic Peptides在線軟件預測(http：//imed.med.uce.es/Tools/antigenic.pl)羊種布魯氏菌的BMEI0742蛋白的抗原決定簇。

1.3.4 蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測 通過SOPMA在線軟件分析(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-automat.pl?page=/NPSA/npsa-sopma.html)羊種布魯氏菌的BMEI0742蛋白的二級結(jié)構(gòu)。

1.3.5 蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測 通過Phyre2在線服務器預測(http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)羊種布魯氏菌的BMEI0742蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

1.3.6 蛋白的3D模型評估 利用PDBsum Generate在線評估(http：//www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/Generate.html)羊種布魯氏菌的BMEI0742蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴增及酶切鑒定

NCBI上羊種布魯氏菌的BMEI0742基因的片段大小為 1 221 bp，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，與實際大小一致，結(jié)果如圖1所示。用相應的限制性內(nèi)切酶(BamH Ⅰ/XhoⅠ)進行雙酶切后，用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。結(jié)果顯示，得到大小與預期結(jié)果相符的基因條帶，表明羊種布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)蛋白BMEI0742基因已經(jīng)成功插入 pET-28a 表達載體中(圖2)。

2.2 重組蛋白表達條件的優(yōu)化

為尋找重組蛋白表達的最佳誘導時間和誘導劑濃度，分別在誘導劑濃度不變的前提下，設置時間梯度篩選最佳誘導時間；在誘導時間不變的前提下，設置誘導劑濃度梯度篩選最佳誘導劑濃度，進而篩選出最佳的誘導條件。結(jié)果顯示，誘導劑IPTG的終濃度為1 mmol/L，誘導8 h時重組蛋白表達量最高，結(jié)果如圖3所示。蛋白大量誘導表達后經(jīng)AKTA蛋白純化系統(tǒng)純化，SDS-PAGE分析表明，純化后的蛋白條帶清晰，無雜帶，表明純化效果較好(圖4)。

2.3 Western-Blot檢測

對誘導8 h后的重組蛋白純化后進行Western-Blot檢測，200 mA恒流電流下轉(zhuǎn)膜50 min，經(jīng)觀察，可見明顯的陽性條帶，說明誘導得到的重組蛋白能被HRP標記的兔抗綿羊IgG抗體識別，且大小與pET-28分子質(zhì)量加上目標分子蛋白質(zhì)量的重組蛋白總分子質(zhì)量相符，結(jié)果如圖5所示。

2.4 目的蛋白的生物信息學分析

通過TMHMM Server v.2.0在線軟件分析得出，BMEI0742蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)(圖6)。通過SignalP 4.1 Server在線預測得出，BMEI0742蛋白沒有信號肽(圖7)。經(jīng)Predicting Antigenic Peptides在線軟件得出，BMEI0742蛋白有18個抗原決定簇(圖8)。

經(jīng)SOPMA在線軟件分析得出，BMEI0742蛋白中有127個氨基酸參與形成α-螺旋，占所有氨基酸的32.48%；99個氨基酸參與延伸鏈的形成，占所有氨基酸的25.32%；45個氨基酸參與β-折疊的形成，占所有氨基酸的11.51%；另外，還有120個氨基酸參與無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的形成，占所有氨基酸的30.69%(圖9)。通過Phyre2在線服務器分析預測，BMEI0742蛋白的三級結(jié)構(gòu)如圖10所示。經(jīng)PDBsun Generate在線評估，在BMEI0742蛋白的3D同源模型的Ramachandran圖中可以看出，375個氨基酸殘基中有250個處于核心允許區(qū)，占78.9%；58處于額外允許區(qū)，占 18.3%；7個處于最大允許區(qū)，占2.2%；同時，也存在0.6%的氨基酸位于不允許區(qū)域中，這說明該模型具有一定的可信度，結(jié)果如圖11所示。

3 討論與結(jié)論

布病在全球170多個國家和地區(qū)流行，主要分布于地中海、非洲、拉丁美洲、中東和亞洲的部分地區(qū)[17]。我國各省(市、區(qū))均有人、畜不同程度的布病流行。隨著經(jīng)濟的發(fā)展，布病已經(jīng)開始從牧區(qū)轉(zhuǎn)向工業(yè)化或者是人口密集的經(jīng)濟發(fā)達地區(qū)蔓延。同時，商務和休閑旅游等產(chǎn)業(yè)的發(fā)展、人口流動的增加促使布病非疫區(qū)新發(fā)病例呈上升態(tài)勢[18]。

生物信息學是利用計算機作為輔助工具，對生物信息數(shù)據(jù)進行整理歸納，探索生物奧秘的科學，它主要體現(xiàn)在基因組學和蛋白組學兩大領域。布魯氏菌基因組的測序與分析為揭示布魯氏菌生存機制、分類與進化、毒力演化、疫苗株的弱化機制等提供有力支持，為闡述布魯氏菌毒力相關基因的演化歷史提供依據(jù)。自2002年羊種布魯氏菌16M參考基因組測序完成以來，已經(jīng)有300多株布魯氏菌基因組完成了測序，其中有16株基因組已經(jīng)完成了精細物理圖譜的繪制[19]。隨著蛋白質(zhì)組學的發(fā)展，羊種布魯氏菌和牛種布魯氏菌蛋白質(zhì)組學的研究都有不少報道，包括全菌蛋白質(zhì)組學[20]、膜蛋白質(zhì)組學[21-22]、免疫蛋白質(zhì)組學[23-24]、分泌蛋白質(zhì)組[3]等都有研究。本研究對BMEI0742蛋白進行了生物信息學分析，有助于了解蛋白質(zhì)的功能，為布魯氏菌的致病機制研究作基礎。

細菌EF-Tu是翻譯過程中重要的蛋白因子，也是含量最多的蛋白之一，在原核生物中廣泛存在[25]，且高度保守，被廣泛用來進行種系發(fā)生分析[26]。最近的研究表明，EF-Tu是一種重要的多功能蛋白，不僅僅是作為蛋白翻譯因子起作用，而且更重要的是EF-Tu參與許多重要的細胞和疾病過程，包括信號傳導、翻譯控制、凋亡、細胞骨架組成等。EF-Tu 沒有信號膚卻能聯(lián)合其他一些缺乏分泌信號的蛋白以類似外吐小體(exosome)的運輸方式分泌并干擾宿主細胞信號傳遞[27]。EF-Tu蛋白自身也具有較強的免疫原性，在細菌中高度保守，且該蛋白在其他多個種屬細菌中已有關于作為鑒別診斷和候選亞單位疫苗的潛力的報道[28]。在綿羊布氏桿菌疫苗株M5-90致弱分子機制的研究過程中發(fā)現(xiàn)，EF-Tu具有很強的免疫原性，而重組的EF-Tu蛋白免疫小鼠后可以部分抵抗強毒株羊種布魯氏菌M28的攻擊[29]。顯然，EF-Tu在多種細菌中均具有誘導宿主免疫應答的能力。這說明EF-Tu蛋白在細菌感染宿主的過程中，作為一種重要的免疫原被宿主細胞所識別和捕獲，可能在其致病過程中發(fā)揮重要作用。

經(jīng)過BMEI0742蛋白的生物信息學分析顯示，BMEI0742蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)，不能進行胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導等生命活動。BMEI0742蛋白沒有信號肽，說明BMEI0742蛋白屬于非分泌型蛋白。BMEI0742蛋白擁有一定數(shù)量的抗原表位，表明BMEI0742蛋白作為抗原能引起良好的免疫應答反應。BMEI0742蛋白的二級結(jié)構(gòu)是以α-螺旋為主，都是通過骨架上的羥基和酰胺集團之間形成的氫鍵維持二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。本研究成功構(gòu)建了BMEI0742蛋白的三維模型，該模型具有一定的可信度，有利于蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的可視化分析，具體的生物學功能需要進一步的試驗驗證。

總之，布魯氏菌的病原與宿主的相互作用是一個非常復雜的過程。本研究通過構(gòu)建布魯氏菌BMEI0742基因的原核表達載體并對其反應原性進行鑒定以及生物信息學分析，為進一步研究EF-Tu在布魯氏菌感染宿主細胞過程中所發(fā)揮的生物學功能提供依據(jù)。