韓業(yè)東，張振梅

（1.遼寧省畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，遼寧 沈陽 110003；2.沈陽市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，遼寧 沈陽 110000）

Na+-K+-ATP酶（NKA），是一類廣泛存在于真核生物細(xì)胞膜上的跨膜載體蛋白，是細(xì)胞內(nèi)離子轉(zhuǎn)運和能量代謝的重要系統(tǒng)，直接或間接地參與細(xì)胞內(nèi)外的離子調(diào)節(jié)，機體的生理活動和體溫調(diào)節(jié)過程。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)Na+和K+的平衡主要有NKA來調(diào)節(jié)，NKA活性的降低可引起細(xì)胞的離子跨膜轉(zhuǎn)運障礙，能量代謝和物質(zhì)代謝的紊亂。多位學(xué)者證實在炎熱的夏季，持續(xù)高溫造成的熱應(yīng)激可導(dǎo)致奶牛直腸溫度、呼吸頻率、紅細(xì)胞鉀、產(chǎn)奶量發(fā)生明顯的變化。研究發(fā)現(xiàn)，荷斯坦牛紅細(xì)胞NKA活力與產(chǎn)奶量下降率極顯著負(fù)相關(guān)。在本研究中，我們對荷斯坦奶牛NKA1B2基因內(nèi)含子4上的SNP進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析，從不同基因型分析對產(chǎn)奶量的影響以及對體溫，鉀離子，紅細(xì)胞鈉鉀泵的變化，以其為荷斯坦耐熱奶牛的選育提供理論依據(jù)和參考指標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

從規(guī)?；膛鲋须S機挑選具有完整DHI記錄（乳脂率、乳蛋白率、305天產(chǎn)奶量及體細(xì)胞數(shù)）的同一胎次中國荷斯坦奶牛836頭。所有生產(chǎn)數(shù)據(jù)通過Foss 6000乳成分及體細(xì)胞聯(lián)機分析系統(tǒng)檢測獲得。體溫分階段場內(nèi)測定，生化指標(biāo)實驗室測定。靜脈采血(10毫升/頭)，ACD抗凝，-20℃保存。

1.2 NKA1B2的SNP檢測

根據(jù)牛NKA1B2基因全序列(NCBI登錄號：NC_007317-2)，使用Primer5.0軟件，設(shè)計2對引物(見表1)。以DNA池為模板，按照（PCR反應(yīng)體系均為25微升，包括10×buffer2.5微升，25毫摩爾/升Mg2＋1.8微升，10毫摩爾/升dNTPs0.5微升，10微摩爾/升上、下游引物各0.8微升，模板DNA 1.0微升，5單位/微升Taq DNA 聚合酶0.5微升，三蒸水17.1微升。PCR擴增條件為：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，退火（退火溫度見表1）30秒，72℃延伸30秒，35個循環(huán)， 最后72℃延伸7分鐘）PCR體系進(jìn)行反應(yīng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后測序。

1.3 NKA1B2基因分型

用PCR-SSCP來進(jìn)行基因分型，方法是把6微升PCR產(chǎn)物加入25微升離心管中，然后再加入9微升變性劑（95%甲酰胺，25毫摩爾EDTA，0.025%二甲苯青，0.025%溴酚藍(lán)），98℃變性10分鐘，迅速冰浴5分鐘。變性的DNA用10%PAGE電泳（80×73×0.75毫米），1×TBE buffer，穩(wěn)壓（120伏），4℃，電泳10～14小時，用0.1%硝酸銀進(jìn)行染色，根據(jù)PCR-SSCP電泳結(jié)果判斷每一個體的基因型。

1.4 耐熱評定指標(biāo)的測定

將-20℃的ACD抗凝血5毫升，靜置溶解后于4℃、3000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，分離血清抽提基因組DNA（酚-氯仿法），然后按1∶2體積加入生理鹽水， 輕輕搖勻，4℃、7000轉(zhuǎn)/分鐘離心8分鐘，棄上清，重復(fù)洗3次，最后制得純凈的紅細(xì)胞。用移液槍插入試管底部， 準(zhǔn)確吸取0.5毫升紅細(xì)胞轉(zhuǎn)移到加有1毫升滅菌生理鹽水的1.5毫升離心管中，標(biāo)號冷藏待測紅細(xì)胞k+（原子吸光法），剩余的紅細(xì)胞用于制備紅細(xì)胞膜（低滲溶血法），測定紅細(xì)胞NKA活力（無機磷比色法）。

1.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

統(tǒng)計中國荷斯坦奶牛的基因頻率和基因型頻率，計算χ2值、多態(tài)信息含量(PIC)、有效等位基因數(shù)(Ne)和位點的雜合度(H)。在最小二乘法擬合線性模型中用SPSS13.0軟件比較中國荷斯坦奶牛的乳脂率、乳蛋白率、305天產(chǎn)奶量、體細(xì)胞評分（SCS）在不同基因型之間的差異。分析中使用固定效應(yīng)的線性模型是：Yijkil=u+hi+pj+sk+ml+eijkli（其中：Yijkil=耐熱性能觀察值；u=群體均值；hi=基因型的固定效應(yīng)值；pj=父本的固定效應(yīng)值；sk=母本的固定效應(yīng)值；ml=產(chǎn)奶性能效應(yīng)值；eijkli=隨機殘差效應(yīng)）。結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”的形式表示。

2 試驗結(jié)果

2.1 擴增產(chǎn)物電泳，測序和分型

PCR擴增經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，都產(chǎn)生了清晰的、能夠準(zhǔn)確判斷的目的條帶756bp和173bp，隨機抽取部分樣本進(jìn)行兩次重復(fù)測序，同時發(fā)現(xiàn)第4內(nèi)含子的C2833T突變，通過PCR-SSCP分型，發(fā)現(xiàn)3種基因型CC、CT和TT，見圖1。

圖1 NKA1B2基因的C2833T位點特征

2.2 群體遺傳學(xué)分析

P C R-S S C P檢測到C2833T位點具有兩個等位基因（C、T），三種基因型（C C、C T、T T），等位基因頻率和基因型頻率、多態(tài)信息含量（PIC）、雜合度（H）、有效等位基因數(shù)（Ne）、卡方（χ2）見表2。

表1 引物設(shè)計

表2 C2833T在荷斯坦牛群體中的遺傳多樣性

表3 NKA1B2基因不同基因型個體的產(chǎn)奶量

表4 NKA1B2基因不同基因型個體的體溫

表5 NKA1B2基因不同基因型個體紅細(xì)胞k+

表6 NKA1B2基因不同基因型個體的紅細(xì)胞NKA

2.3 NKA1B2不同基因型與產(chǎn)奶量的相關(guān)分析

表3分析中國荷斯坦牛NKA1B2基因2833位點的CT基因型個體產(chǎn)奶量在熱應(yīng)激期顯著低于TT基因型個體，在非熱應(yīng)激期CT基因型個體產(chǎn)奶量顯著低于CC和TT基因型個體。

2.4 NKA1B2不同基因型與耐熱評定指標(biāo)的相關(guān)分析

由表4可知，中國荷斯坦牛NKA1B2基因2833位點的CT基因型個體體溫在熱應(yīng)激期極顯著高于CC和TT基因型個體。

由表5可知，中國荷斯坦牛NKA1B2基因2833位點的CT基因型個體紅細(xì)胞k+在熱應(yīng)激期顯著高于TT基因型個體。

由表6可知，中國荷斯坦牛NKA1B2基因2833位點的TT基因型個體紅細(xì)胞NKA活力在熱應(yīng)激期顯著高于CC和TT基因型個體。

3 討論

熱應(yīng)激期，中國荷斯坦牛體溫升高、紅細(xì)胞K+、產(chǎn)奶量和紅細(xì)胞NKA活力都降低，這與李建國、穆玉云、史彬林、楊淑晶的研究結(jié)果相一致；TT基因型個體在熱應(yīng)激期表現(xiàn)出體溫較低，紅細(xì)胞鉀低，產(chǎn)奶量下降率低，NKA活力下降率低的優(yōu)良特征，具有很好的耐熱性。許多研究表明NKA與多種疾病有關(guān)，一般都有NKA活性的下調(diào)，可引起細(xì)胞的離子跨膜轉(zhuǎn)運障礙，能量代謝和物質(zhì)代謝紊亂。紅細(xì)胞NKA是細(xì)胞從胞外攝取K+的唯一途徑，NKA活性抑制，導(dǎo)致細(xì)胞攝取K+的能力降低；NKA活性降低，將不能利用ADP的磷酸化生成ATP使體內(nèi)底物氧化釋放的能量以熱的形式散發(fā)，導(dǎo)致體溫升高，但NKA在熱應(yīng)激過程中活性下調(diào)導(dǎo)致體溫升高是否遵循ATP的偶聯(lián)機制有待研究論證；哺乳動物成熟的紅細(xì)胞所需能量幾乎完全依靠葡萄糖酵解而取得，酵解產(chǎn)生的ATP主要用于維持細(xì)胞膜上的NKA的運行，如ATP缺乏，則膜內(nèi)外離子平衡失調(diào)，使動物細(xì)胞質(zhì)膜中依賴于離子梯度形式貯存的能量推動的糖和氨基酸的代謝發(fā)生紊亂，這與熱應(yīng)激期產(chǎn)奶量的下降是否關(guān)聯(lián)有待進(jìn)一步研究。在生產(chǎn)中奶牛熱應(yīng)激時，采食量下降，Na+、K+等攝入減少，唾液分泌增加，皮膚汗液蒸發(fā)量增加，也導(dǎo)致體溫升高，血液中Na+、K+損失和產(chǎn)奶量的下降。因此，作者認(rèn)為，奶牛在熱應(yīng)激的初始階段，通過物理性的調(diào)節(jié)，改變自身的呼吸頻率，體溫，唾液和汗液的分泌來抵抗外界高溫環(huán)境，而持續(xù)熱應(yīng)激時，就需要化學(xué)性的調(diào)節(jié)，改變體內(nèi)的激素分泌，ATP水解和物質(zhì)代謝來抵抗持續(xù)高溫。在夏季生產(chǎn)中看到奶牛采食減少、站立不動、吐舌流哈、體表隱汗和檢測到體溫升高、產(chǎn)奶量下降、紅細(xì)胞K+下降、紅細(xì)胞NKA活力下降等各種生理生化指標(biāo)的顯著變化可以客觀的驗證奶牛處于熱應(yīng)激。

4 結(jié)論

本研究測序發(fā)現(xiàn)中國荷斯坦牛NKA1B2基因的第4內(nèi)含子存在新的SNP位點C2833T，PCR-SSCP分型發(fā)現(xiàn)3種基因型CC、CT和TT，都與產(chǎn)奶量及生理生化指標(biāo)存在顯著相關(guān)，且TT基因型個體相對具有優(yōu)越的產(chǎn)奶量和良好的熱應(yīng)激抵抗性。因此，NKA1B2基因C2833T可能作為荷斯坦奶牛耐熱性能評定的分子遺傳標(biāo)記，但仍需加大樣本量和試驗研究論證。