付明剛， 迪麗米娜·伊拉木， 郭麗英

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科, 烏魯木齊 830054)

微小RNA (microRNA,miRNA)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類廣泛的存在于動物和植物細胞內(nèi)的非編碼單鏈小分子RNA，其長度約18～25個核苷酸(nucleutide，nt)[1]。目前研究表明，在實體腫瘤細胞中，腫瘤的發(fā)生、進展與miRNA表達水平的異常表達關(guān)系密切[2-3]，并且直接影響腫瘤的的侵襲性[4-5]。本研究通過原位雜交技術(shù)檢測60例石蠟包埋的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌及對應(yīng)的癌旁組織中miR-146a的表達情況，分析其表達與浸潤性乳腺癌相關(guān)的臨床病理指標之間的關(guān)系，從而探討其是否可作為臨床侵襲性及預(yù)后的的分子標志物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1臨床資料收集新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2014年1月-2016年8月手術(shù)治療的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者標本60份，由新疆醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究院標本庫提供，入組患者手術(shù)方式為乳腺癌改良根治術(shù)，乳腺腫瘤直徑≤3 cm，癌旁組織為距癌組織>3 cm的乳腺非腫瘤組織，全部病例均經(jīng)病理證實，病理資料均完整。入組患者均為女性，年齡30～68歲，中位年齡45歲，排除新輔助化療患者；患者均接受規(guī)范化治療，手術(shù)方式為改良根治術(shù)，術(shù)后行表阿霉素+多西他賽(TA)方案輔助化療6個周期，腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)≥4枚行規(guī)范化放療，術(shù)后激素受體陽性患者接受內(nèi)分泌治療，2017年7月31日為隨訪截止時間，平均隨訪時間為23個月。所有標本常規(guī)4%福爾馬林固定后石蠟包埋，切片厚約4 μm。

1.2主要試劑miR-146a地高辛標記探針為Exiqon公司產(chǎn)品；miRNA ISH Buffer Set (FFPE)購自丹麥Exiqon公司；敏感型原位雜交試劑盒(MK1030)購自武漢博士德生物工程有限公司。DAB顯色試劑盒及其它常規(guī)試劑購自新疆寶信生物技術(shù)有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1 原位雜交檢測miR-146a在乳腺癌組織中的表達 切片用脫蠟液常規(guī)脫蠟，3%H2O2室溫下浸泡處理切片10 min，采用蒸餾水洗2次；室溫下用3%檸檬酸稀釋的胃蛋白酶消化15 min，PBS洗3次，每次5 min；預(yù)雜交液37℃預(yù)雜交3 h；添加稀釋濃度為40 μg/mL的miR-146a 探針，原位雜交蓋玻片覆蓋后恒溫箱37℃雜交過夜(約16 h)；2×SSC洗滌液梯度充分洗滌；封閉液37℃封閉60 min；滴加生物素化鼠抗地高辛室溫孵育2 h，PBS漂洗4次，每次5 min；滴加SABC 37℃孵育20 min，PBS洗3次，每次5 min；滴加生物素化過氧化物酶37℃孵育20 min，PBS洗4次，每次5 min；應(yīng)用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，充分水洗，PBS返藍，常規(guī)酒精梯度脫水，二甲苯透明，封片。以上各項檢測均嚴格按照試劑盒操作。

1.3.2 原位雜交及免疫組化結(jié)果判斷 由二位高年資的病理醫(yī)師采用雙盲法對原位雜交結(jié)果進行評定。Olympus顯微鏡下觀察評分，miR-146a陽性標準為：其陽性表達于胞漿，呈黃色或棕黃色顆粒狀或團塊狀。采用定性法判斷結(jié)果：鏡下觀察5個高倍視野(×200)陽性細胞數(shù) <10%為(-), 陽性細胞數(shù)≥10%為(+)。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理。采用χ2檢驗或四格表確切概率法對miR-146a的表達與臨床病理特診進行統(tǒng)計學(xué)處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中miR-146a表達水平本研究采用原位雜交技術(shù)檢測60例乳腺癌石蠟組織切片miR-146a的表達，其陽性表達于胞漿中，呈黃色、棕黃色或棕褐色顆粒狀或團塊狀。miR-146a在乳腺癌組織中陽性表達見圖1a，在癌旁組織陽性表達見圖1b。

a: 癌組織中miR-146a的陽性表達

b: 癌旁組織中miR-146a的陽性表達

圖1miR-146a在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織及癌旁組織中的陽性表達

2.2miR-146a在乳腺癌及癌旁組織中的表達情況比較原位雜交結(jié)果顯示，miR-146a在60例乳腺癌組織中有16例呈陽性表達，陽性表達率為23.3%，miR-146a在60例乳腺癌旁組織中有43例呈陽性表達，陽性表達率為71.7%， miR-146a在乳腺癌組織中的陽性表達率低于癌旁乳腺組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 乳腺癌組織和癌旁組織中miR-146a的表達/例

2.3乳腺浸潤性導(dǎo)管癌miR-146a表達與患者臨床病理特征之間的關(guān)系乳腺浸潤性導(dǎo)管癌miR-146a 表達與患者相關(guān)臨床病理資料之間的關(guān)系見表2。原位雜交結(jié)果顯示，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者miR-146a陽性表達率明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(58.8% vs 14.0%,P=0.001);其表達水平與患者年齡、乳腺腫瘤大小、組織學(xué)分級、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及C-erbB-2受體等激素受體狀態(tài)等無明顯關(guān)系(P>0.05)。

表2 miR-146a表達與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者臨床病理指標間的關(guān)系/例(%)

3 討論

目前的研究表明，miRNA作為一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，通過降解目標RNA而控制基因的表達，參與了生物體的生長、發(fā)育以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等生理病理過程[6-7]；并通過抑制目標mRNA翻譯或誘導(dǎo)目標mRNA降解，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達[8-9]。相關(guān)研究已證實，miRNA成為乳腺癌相關(guān)生物治療靶點[10-12]。miR-146a為miRNA家族中的成員之一，定位于第5號染色體LOC285628基因上，廣泛參與了人類多種實體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過程[13-15]。

許多醫(yī)學(xué)研究證實，miR-146a在許多腫瘤中下調(diào)，推測其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Liu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a在乳腺癌細胞中明顯下調(diào)，通過改變其表達可對RhoA蛋白的作用而直接影響MDA-MB-231乳腺癌細胞的遷移和腫瘤細胞侵襲，提示了miR-146a 作為乳腺癌細胞中的腫瘤抑制物。

原位雜交技術(shù)通過帶有標記物的核酸探針來檢測待測組織中核酸的表達及分布情況，是對miRNA表達的定性分析方法之一。本研究通過原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)相對于癌旁組織，浸潤性乳腺癌組織中miR-146a的表達明顯下調(diào)，其表達與患者年齡、乳腺腫瘤的大小、組織學(xué)分級及激素受體狀態(tài)等無明顯關(guān)系(P<0.05)。本研究在檢測浸潤性乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)， miR-146a表達水平在淋巴結(jié)非轉(zhuǎn)移者中明顯高于轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，提示其表達下調(diào)在乳腺癌的侵襲及轉(zhuǎn)移中存在相關(guān)性，起到抑制腫瘤侵襲的作用。因此，認為miR-146a 可能成為抑制乳腺癌進展的潛在的預(yù)后標志物，但原位雜交技術(shù)為一種半定量檢測，檢測預(yù)后指標的潛在價值有限，仍有待一種定量的方法來佐證。

綜上所述，在本研究發(fā)現(xiàn)相對于乳腺癌癌旁組織，乳腺癌組織中miR-146a的表達水平呈明顯下調(diào)，通過原位雜交實驗發(fā)現(xiàn)其表達水平與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，證明其可能為乳腺癌相關(guān)的一種抑癌基因，可能參與了乳腺癌的進展。因本實驗入選樣本較小，且乳腺癌組織中miR-146a表達下調(diào)抑制乳腺腫瘤的細胞通路機制不明，其具體機制有待于今后更深入的研究證實。