霍奕璇

（遼寧省鞍山市工業(yè)研究院，遼寧 鞍山 114000）

魚類水解蛋白是水解動(dòng)物蛋白的一種，除了保持了原本的營(yíng)養(yǎng)成分外，由于蛋白質(zhì)被水解，成為大量的易溶于水的游離氨基酸以及一些呈味肽，這樣不僅使其風(fēng)味口感更佳同時(shí)也更易被人體所消化吸收，產(chǎn)品特征風(fēng)味的不同主要取決于其氨基酸種類以及配比。在各類海產(chǎn)品中，因品種的不同，蛋白質(zhì)的氨基酸組成也隨之不同，特別是游離氨基酸的組成更顯差異，因此海產(chǎn)品風(fēng)味的不同主要取決于其不同原材料中游離氨基酸的組成。

1 材料與方法

1.1 材料

鳳尾 魚 （干）、麩 皮、米 曲 霉As 3.042、黑 曲 霉As 3.350。

1.2 儀器和設(shè)備

選取SYQ.DSX－280B手提式的不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，722s的分光光度計(jì)，pHS－3C的精密pH 計(jì)，DK－S26電熱恒溫型水浴鍋，KQ－500DB數(shù)控超聲波清洗器等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 制備培養(yǎng)基

1.3.1.1 馬鈴薯培養(yǎng)基（培養(yǎng)霉菌）的配制

土豆0.2kg，蔗糖0.02kg，瓊脂0.02kg，水1L。

土豆去皮，切成1cm的正方塊，然后加水煮沸約0.5h，通過(guò)紗布進(jìn)行過(guò)濾，并在濾液中加一定量的蔗糖和瓊脂，待完全溶解補(bǔ)水直到1L，分裝后濕熱滅菌121℃條件下，0.5h［1］。

1.3.1.2 麥芽汁培養(yǎng)基（培養(yǎng)酵母菌）的配制

首先，向磨碎后的麥芽中加約0.8L的水，然后在鍋中（60～65℃）進(jìn)行糖化，時(shí)間控制在3～4h，直到麥芽汁再無(wú)淀粉反應(yīng)。均勻攪拌后進(jìn)行煮沸過(guò)濾，最后調(diào)節(jié)麥芽汁糖度，控制在8～10，最后進(jìn)行濕熱滅菌121 ℃，30min［2］。

1.3.2 樣品的制備

先將低值魚平均切成0.5cm的小塊，然后與麩皮進(jìn)行混合，并蒸料殺菌（121℃，30min），冷卻直到室溫后接菌，菌種比例為As3.042∶As3.350為3∶1，種曲的接種量為1%，培養(yǎng)溫度為30℃，72h出曲后進(jìn)行接種，發(fā)酵溫度最好為室溫（發(fā)酵歷經(jīng)8月至次年的3月，室溫從29℃變化到20℃），加入料液比約為1∶2.3的18°Bé的鹽水，并進(jìn)行高鹽稀態(tài)發(fā)酵，在發(fā)酵31天左右時(shí)加入耐鹽酵母2.297，接菌量2%。

1.3.3 多肽的粗分離及其分子量的測(cè)定

將已選定的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品通過(guò)凝膠過(guò)濾層析的時(shí)間可以測(cè)定出未知樣品的分子量。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法為以標(biāo)準(zhǔn)蛋白的洗脫體積以及標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量的對(duì)數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，在進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線方程后，根據(jù)樣品自身不同的洗脫體積，可以清晰準(zhǔn)確地算出組分的分子量［3］。

首先測(cè)定出已選定的葡聚糖凝膠G－50的吸光度值A(chǔ)（在紫外280nm的條件下）。確保洗脫條件大致相同，洗脫標(biāo)準(zhǔn)的樣品液為L(zhǎng)－酪氨酸、桿菌肽、中性胰島素以及細(xì)胞色素C，進(jìn)行測(cè)定并逐項(xiàng)記錄每一個(gè)收集管中溶液的吸光度值A(chǔ)，以吸光度的值作為坐標(biāo)的縱坐標(biāo)，洗脫體積作為坐標(biāo)的橫坐標(biāo)，然后繪制出標(biāo)準(zhǔn)的洗脫曲線。按照每一組的洗脫體積，同時(shí)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)的洗脫曲線，可以準(zhǔn)確地計(jì)算出相應(yīng)分子量的大小。

2 結(jié)果與分析——多肽的粗分離及其分子量

2.1 采用Sephadex G－50對(duì)發(fā)酵90天的樣品進(jìn)行粗分離

本實(shí)驗(yàn)采用1.7cm×60cm規(guī)格的Sephadex G－50葡聚糖凝膠柱，該凝膠柱適用于粗分離分子量介于30～1.5kDa的樣品，以0.9mol/L的NaCl溶液為洗脫液，首先對(duì)樣品的上樣以及其他條件進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整。

2.1.1 上樣量的確定

按照凝膠柱的安裝要點(diǎn)裝柱后，凝膠柱的有效柱長(zhǎng)為44cm，凝膠柱的規(guī)格為1.7cm×60cm，因此計(jì)算出凝膠柱的有效柱長(zhǎng)體積為99.8mL，按照規(guī)定的要求，確定上樣量應(yīng)為柱床體積的1%～5%，因此對(duì)上樣量范圍限定為1～5mL。選擇分別為1，2mL的上樣量，流速設(shè)定為0.6mL/min，單試管的收集量約為2.4mL，見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 上樣量為1mL的洗脫曲線Fig.1The elution curve of loading quantity of sample of 1mL

圖2 上樣量為2mL的洗脫曲線Fig.2The elution curve of loading quantity of sample of 2mL

由圖1和圖2可知，當(dāng)上樣量為2mL時(shí)，樣品相對(duì)過(guò)多，第1個(gè)峰和第2個(gè)峰并沒(méi)有完全地進(jìn)行分開，并且在60～80管中間，存在“拖尾”的現(xiàn)象，分離效果遠(yuǎn)不如上樣量為1mL時(shí)的效果好；因此對(duì)比曲線分析，建議選擇上樣量為1mL。

2.1.2 流速的確定

設(shè)定的流速分別在0.4，0.6mL/min，并將兩管的收集體積均設(shè)置在2.4mL，見(jiàn)圖3和圖4。

圖3 當(dāng)流速設(shè)定為0.4mL/min時(shí)的洗脫曲線Fig.3The elution curve when the flow rate is set to 0.4mL/min

圖4 當(dāng)流速設(shè)定為0.6mL/min時(shí)的洗脫曲線Fig.4The elution curve when the flow rate is set to 0.6mL/min

由圖3和圖4可知，當(dāng)流速設(shè)定為0.4mL/min時(shí)，洗脫到30管左右時(shí)，可以看到兩峰之間有重疊現(xiàn)象，分離速度過(guò)慢導(dǎo)致分離效果不好；流速為0.6mL/min時(shí)的洗脫曲線峰形較好，峰形明顯，有4個(gè)組分被分離出來(lái)，因此選擇流速為0.6mL/min。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用1.7cm×60cm的Sephadex G－50葡聚糖凝膠洗脫樣品，用0.09mol/L的溶液進(jìn)行洗脫，分離的條件設(shè)定為：上樣量設(shè)定為1mL，流速設(shè)定為0.6mL/min，洗脫液的接受容量約為2.4mL。樣品分離成為4組組分，最大的吸收峰出現(xiàn)在第24管、34管、43管和61管。

2.2 發(fā)酵90天樣品的分子量

標(biāo)準(zhǔn)品的分子量：通過(guò)牛血清白蛋白、細(xì)胞色素C、中性胰島素、桿菌肽做標(biāo)準(zhǔn)曲線。各標(biāo)準(zhǔn)樣品洗脫曲線見(jiàn)圖5～圖8。

圖5 牛血清白蛋白洗脫曲線Fig.5The elution curve of BSA

圖6 細(xì)胞色素C洗脫曲線Fig.6The elution curve of cytochrome C

圖7 中性胰島素的洗脫曲線Fig.7The elution curve of neutral insulin

圖8 桿菌肽洗脫曲線Fig.8The elution curve of bacitracin

各標(biāo)準(zhǔn)品出峰的管數(shù)及洗脫體積與分子量之間的關(guān)系見(jiàn)表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫體積和分子量間的關(guān)系Table 1The relation between molecular weight and elution volume of the standard substance

根據(jù)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品分子量對(duì)數(shù)和洗脫體積，得出標(biāo)準(zhǔn)洗脫曲線，見(jiàn)圖9。

圖9 分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.9The standard curve of the molecular weight

由圖9可知，回歸方程Y＝5.47145－0.0165X，相關(guān)系數(shù)為R2＝0.9940。按照小分子肽分離組分中最大的吸收峰為第24管、第34管、第43管和第61管，可以計(jì)算出其分子量分別為33193.17，13336.75，6430.578，1137.274Da。由分子量可知，組分中含有尚未被分解的蛋白質(zhì)、長(zhǎng)鏈多肽。根據(jù)出峰位置可以算出，分子量分布在30000Da左右的肽段，占所有分離組分的2.36%，分子量分布在10000Da的肽段占所有分離組分的8.66%，分子量分布在10000～2000Da的肽段占所有分離組分的82.88%，分子量分布在1000～2000Da的肽段占所有分離組分的5.66%。

2.3 采用Sephadex G－50對(duì)發(fā)酵180天樣品進(jìn)行粗分離

圖10 上樣量為1mL的洗脫曲線Fig.10The elution curve of input 1mL

由圖10可知，明顯有4個(gè)峰形。分為第25管、33管、42管和62管。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)洗脫曲線方程，我們可計(jì)算出其分子量分別為30300.52，14609.99，6430.578，1004.015Da。本實(shí)驗(yàn)采用微積分原理，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)繪制洗脫曲線的全過(guò)程，上面的兩個(gè)點(diǎn)之間所形成的圖形類似看作梯形，梯形的上部分與平滑曲線之間部分可以忽略不計(jì)；將所有組成的梯形進(jìn)行相互疊加，與得到的洗脫曲線峰的總面積比較。通過(guò)出峰位置的管數(shù)可以算出，分子量在30000Da左右分布的肽段占所有分離組分的2.04%，分子量分布在10000Da的肽段占所有分離組分的9.31%，分子量分布在10000～2000Da的肽段，占所有分離組分的83.58%，分子量分布在1000～2000Da的肽段占所有分離組分的5.06%。

對(duì)比不同發(fā)酵時(shí)間下的分子量分布可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，分子量分布在30000Da左右的肽段，所占比例有下降趨勢(shì)，從發(fā)酵90天的2.36%下降到2.04%；分子量分布在10000Da的肽段，所占比例有上升趨勢(shì)，從90天的8.66%上升到9.31%；分子量分布在10000～2000Da的肽段，所占比例有上升趨勢(shì)，從90天的82.87%上升到83.59%；分子量分布在1000～2000Da之間的肽段，相應(yīng)比例呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，從90天的6.10%下降到5.06%。但整體趨勢(shì)變化并不顯著，呈動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，這是因?yàn)樵诎l(fā)酵的過(guò)程中，在相應(yīng)的酶的催化作用下，大分子中的肽慢慢地降解成為小分子的肽，甚至降解成為游離氨基酸。同時(shí)，小分子中的肽也進(jìn)一步降解，逐漸成為游離氨基酸，某一肽段所占比例的升高都會(huì)引起另一肽段所占比例的下降。

3 小結(jié)

總體看來(lái)，不同發(fā)酵時(shí)間下的肽段主要集中在2000～10000Da，占所有肽段的80%。變化不顯著主要是由于在發(fā)酵的后期，中性蛋白酶和酸性蛋白酶活力逐漸降低，對(duì)蛋白質(zhì)的生成和降低所發(fā)揮的作用逐漸減小，其大分子中肽段開始降解的速度和小分子中肽段開始生成的速度達(dá)到了動(dòng)態(tài)平衡，所以發(fā)酵后期變化較小。

分子量1000Da的肽段比例呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明部分肽段越來(lái)越多地降解為游離氨基酸，這與氨基態(tài)氮的升高呈一定的負(fù)相關(guān)性。

隨著小分子量的肽段逐漸增多，發(fā)酵液的風(fēng)味愈發(fā)豐富，這是由于大量呈味氨基酸的溶出和生成，其中常見(jiàn)的氨基酸如天門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、等都極具鮮味。其中鮮味最為強(qiáng)烈的當(dāng)屬谷氨酸；呈甜味的氨基酸中含有甘氨酸、蘇氨酸、色氨酸、脯氨酸、丙氨酸等；再加上發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的琥珀酸、丁酸、乳酸、戊酸、異戊酸、檸檬酸以及醇類和有機(jī)酸等生成的酯類等，最終形成低值魚調(diào)味品的風(fēng)味。