孫一帆，梁新紅，高瑩瑩，夏夢玉

（河南科技學(xué)院 食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

葡萄醋作為近年來新興的功能飲料，既保留了醋的主要功能，又具有葡萄酒保健的特點，酸甜而爽口，老少皆宜，其豐富的營養(yǎng)價值使葡萄醋兼具葡萄酒和果醋的雙重功效［1］，具有降低血壓、促進消化、提高人體免疫力、抗癌、延緩衰老、保護心血管等多種保健功能［2－4］。

本文以實驗自制葡萄酒為基本原料，以醋酸菌A.pasteurianusSP001為菌種，通過單因素控制發(fā)酵條件，對醋酸菌發(fā)酵生成的醋酸動態(tài)變化進行研究，探索了脅迫條件對醋酸生成的影響［5，6］。本方法的優(yōu)點是實驗所采用的分析和檢驗方法、儀器、試劑，以經(jīng)濟實用為主，實驗可操作性強。該研究為葡萄醋工業(yè)化生產(chǎn)條件控制提供理論及實踐意義。

1 材料和方法

1.1 材料

葡萄酒：河南科技學(xué)院食品學(xué)院實驗室釀造。菌種：A.PasteurianusSP001，河南科技學(xué)院食品學(xué)院實驗室分離純化。

1.2 試驗方法

1.2.1 儀器及設(shè)備

YXQ－LS－50立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；BS223S電子天平 賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司；HZP－250全溫振蕩培養(yǎng)箱、SH－250P生化培養(yǎng)箱 上海精宏實驗儀器公司；WFJ7200分光光度計 尤尼克（上海）儀器有限公司；電子萬用電爐 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；BCD－227CHT冰箱 中國新飛有限公司。

1.2.2 試劑

鄰苯二甲酸氫鉀、碳酸鈣、無水醋酸、無水乙醇（AR分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；瓊脂粉（BR生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；酚酞（IND指示劑，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心）；葡萄糖（BR生物試劑，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）。

1.3 葡萄酒釀造工藝

1.3.1 工藝流程

1.3.1.1 步驟

1.3.1.2 操作要點

菌種活化：固體醋酸菌菌種，接入酒精度為6%（V/V）的葡萄酒發(fā)酵液中，接種量為10%，30℃恒溫發(fā)酵44h，備用。

接種：接種量為10%（V/V）。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 酒精度對醋酸含量的影響

考察不同酒精度對葡萄醋醋酸發(fā)酵的影響。發(fā)酵起始酒精度加水稀釋，分別調(diào)整為2%，4%，6%，8%，10%，發(fā)酵溫度設(shè)為30℃，接種量10%，培養(yǎng)基pH為自然，發(fā)酵時間為10天。

1.3.2.2 發(fā)酵溫度對醋酸含量的影響

考察溫度作為葡萄醋發(fā)酵的影響因素。單因素發(fā)酵溫度分別設(shè)定為：20，25，30，35，40 ℃，發(fā)酵液各成分酒精度為6%，接種量為10%，培養(yǎng)基pH為自然。

1.3.2.3 殘?zhí)橇繉Υ姿岷康挠绊?/p>

考察不同殘?zhí)橇孔鳛槠咸汛状姿岚l(fā)酵的影響因素，發(fā)酵時單因素殘?zhí)呛糠謩e設(shè)定為：5，10，15，20，25g/L，發(fā)酵溫度為30℃，接種量為10%，培養(yǎng)基pH為自然。

1.3.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計

響應(yīng)面試驗因素與水平表見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素和水平表Table 1Factors and levels of response surface analysis

響應(yīng)面分析法是采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值間的函數(shù)關(guān)系，通過回歸方程分析得到最佳的工藝參數(shù)。本試驗考察酒精度、發(fā)酵溫度、殘?zhí)橇繉Πl(fā)酵工藝的影響，依據(jù)回歸分析確定各工藝條件的影響因子，以醋酸含量為響應(yīng)值做響應(yīng)面與等值線圖，分析優(yōu)化最佳提取條件［7，8］。

1.4 分析方法

1.4.1 醋酸含量的測定

以標定后的氫氧化鈉溶液（濃度接近0.1mol/L）滴定發(fā)酵液，以指示劑為酚酞試劑，結(jié)果以醋酸（g/dL）計。為了保證測量結(jié)果的準確性，每次測定進行統(tǒng)一操作，步驟：1mL發(fā)酵液→加入9mL蒸餾水→加2滴酚酞→滴定記錄［9］。

1.4.2 酒精度的測定

蒸餾法測葡萄酒中乙醇的含量：取100mL葡萄酒加入蒸餾瓶中，加熱直至酒精不再餾出，約50mL左右，餾出液用干燥的錐形瓶收集，用酒精計測量餾出物的酒精度。

1.4.3 殘?zhí)呛康臏y定

DNS法測定還原糖含量：標準曲線繪制，取7支具有25mL刻度的血糖管或刻度試管，按表2的量準確加入1mg/mL的葡萄糖標準溶液和3，5－二硝基水楊酸試劑（DNS試劑）［10，11］。

表2 DNS法繪制標準曲線Table 2Standard curve drawn by DNS method mL

將各試管搖勻，在沸水浴中加熱5min，取出后立即放入盛有冷水的燒杯中，冷卻至室溫，再以蒸餾水定容至10mL刻度處，用橡皮塞塞住管口，顛倒混勻。在540nm波長下，用0號管調(diào)零，分別讀取1～6管的吸光值。以吸光值為縱坐標，葡糖糖濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

試管→吸取稀釋適當倍數(shù)后的葡萄酒樣品液0.5mL→加蒸餾水1.5mL，搖勻→加水楊酸試劑（DNS）1.5mL→搖勻，沸水浴5min，取出冷卻至室溫。以蒸餾水定容至10mL，顛倒混勻，在540nm波長下測定吸光度，用0號管調(diào)零。

在標準曲線上查出相應(yīng)還原糖含量（mg），按照下式計算出還原糖含量（%）：

還原糖＝［C×（V/α）］/W×1000×100%。

式中：C為標準曲線上取得的還原糖（mg）；V為葡萄酒樣品液的體積（mL）；α為稀釋后提取樣品液體積（mL）；W為樣品重。

2 結(jié)果與分析

2.1 殘?zhí)菧y定標準曲線

圖1 DNS法標準測定標準曲線Fig.1Standard curve determined by DNS method

由圖1可知，DNS法測定還原糖含量的標準曲線為：y＝1.2377X－0.0723，決定系數(shù) R2為0.9939，表明曲線擬合較好。

2.2 單因素試驗結(jié)果與分析

2.2.1 酒精度對葡萄醋醋酸發(fā)酵的影響

考察不同酒精度對葡萄醋醋酸發(fā)酵的影響。發(fā)酵起始酒精度設(shè)定為2%，4%，6%，8%，10%，發(fā)酵溫度設(shè)定為30℃，接種量10%，培養(yǎng)基pH為自然，發(fā)酵時間為10天，結(jié)果見圖2。

圖2 酒精度對葡萄醋醋酸發(fā)酵的影響Fig.2Effect of alcoholic strength on acetic acid fermentation of grape vinegar

隨著起始酒精度的增加，醋酸生成量逐漸增加，當酒精度達到6%時，醋酸含量達到最大值，為（5.86±0.11）g/dL。隨著酒精的增加，酒精向醋酸的轉(zhuǎn)化率逐漸升高，在酒精度超過6%時，醋酸含量出現(xiàn)下降趨勢，在10%時下降至（1.43±0.09）g/dL，說明當酒精度超過6%后，酒精幾乎不再轉(zhuǎn)化，當起始酒精度高于6%發(fā)酵液幾乎沒有醋酸產(chǎn)生，這可能是因為醋酸菌對高酒精度較敏感，也有可能是葡萄酒中的其他成分影響了醋酸發(fā)酵，具體原因需要進一步分析。綜合分析可知該醋酸菌的最佳發(fā)酵酒精度為6%，因此選擇6%為最佳酒精度。

2.2.2 溫度對葡萄醋醋酸發(fā)酵的影響

圖3 溫度對葡萄醋醋酸發(fā)酵的影響Fig.3Effect of temperature on acetic acid fermentation of grape vinegar

由圖3可知，溫度對A.pasteurianusSP001發(fā)酵產(chǎn)醋酸有重大影響，隨著發(fā)酵溫度的提高，醋酸生成量逐漸增加。在30℃條件下，醋酸含量由（2.036±0.07）g/dL增加到（5.92±0.13）g/dL，達到最大值。當溫度繼續(xù)升高時，醋酸含量出現(xiàn)下降趨勢，在40℃時下降至（3.67±0.08）g/dL，可見當發(fā)酵溫度低于30℃時，醋酸菌生長緩慢，醋酸產(chǎn)生量低，發(fā)酵時間較長；當發(fā)酵溫度高于30℃時，醋酸菌生長加快，產(chǎn)酸迅速，發(fā)酵時間縮短，但是由于溫度過高和醋酸生成過快，不利于醋酸菌的后期生長，且加速了酒精和醋酸的蒸發(fā)，使得醋酸含量有減少趨勢。所以，葡萄醋最佳發(fā)酵溫度為30℃。

2.2.3 殘?zhí)橇繉ζ咸汛状姿岚l(fā)酵的影響

圖4 殘?zhí)橇繉ζ咸汛状姿岚l(fā)酵的影響Fig.4Effect of residual sugar content on acetic acid fermentation of grape vinegar

由圖4可知，隨著糖含量的增加，醋酸含量有所提高，糖含量為15g/L時，醋酸含量達到最高點，為（6.07±0.22）g/dL，當糖含量超過15g/L后，醋酸生成量逐漸減少，糖含量為20g/L時，醋酸含量為（5.18±0.06）g/dL。這可能是糖含量較低時，促進了醋酸菌的繁殖，但糖含量過高反而抑制醋酸菌的生長，影響了酒精向醋酸轉(zhuǎn)化作用，發(fā)酵階段也不排除過量葡萄糖向醋酸轉(zhuǎn)化的可能，也可能是因為葡萄酒稀釋倍數(shù)過大，乙酸化過程變得更加困難。因此，最佳殘?zhí)橇繛?5g/L。

2.3 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.3.1 回歸方程的建立和方差分析

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，采用Box－Benhnken設(shè)計方案進一步優(yōu)化，獲得相應(yīng)試驗數(shù)據(jù)，見表3，并采用 Design－Expert 8.0.5軟件進行多元回歸擬合，得到醋酸含量對酒精度、發(fā)酵溫度、殘?zhí)呛康亩味囗椈貧w方程為：Y＝6.12＋0.071A－0.61B－0.11C＋0.097AB＋0.055AC－0.21BC－0.31A2－2.23B2－0.38C2。

表3 響應(yīng)面設(shè)計方案及結(jié)果Table 3Scheme and results of response surface design

方差分析及顯著性檢驗結(jié)果見表4。

表4 回歸模型方差分析及顯著性檢驗Table 4Variance analysis and significance test of regression model

由表4可知，該回歸方程模型極顯著（P＜0.0001），失擬項P＝0.1544＞0.05，失擬性檢驗結(jié)果不顯著。相關(guān)系數(shù)R2＝0.9991，表明響應(yīng)模型可以解釋99.91%的總體變異，只有0.09%的變異無法用模型來解釋，回歸模型有高度相關(guān)性，可以應(yīng)用于葡萄酒釀造的理論預(yù)測。對模型回歸方程系數(shù)顯著性試驗表明：一次項X1為顯著，X2和X3為極顯著；交互項X1X2為顯著，X1X3為不顯著，X2X3二次項影響為極顯著。各因子對醋酸含量的影響依次是X2（溫度）＞X3（殘?zhí)橇浚綳1（酒精度）。

2.3.2 兩因子間交互作用分析

曲面坡度的平緩與陡峭程度直接反映在處理條件發(fā)生變化時醋酸含量的響應(yīng)靈敏程度，如果響應(yīng)面曲面坡度平緩，表明對于處理條件的變化響應(yīng)值不敏感，反之則為敏感。由響應(yīng)值和各試驗因子構(gòu)成間的立體曲面圖，顯示了酒精度、發(fā)酵溫度、殘?zhí)呛恐腥我?個變量取零水平時其余2個變量對醋酸含量的影響，見圖5。

圖5 各交互因素對醋酸含量的響應(yīng)面圖Fig.5Response surface figures of interaction factors to acetic acid content

圖5中a為殘?zhí)呛?5g/L時，酒精度和發(fā)酵溫度對醋酸含量的交互作用。當發(fā)酵溫度一定時，隨著酒精度增加，醋酸含量先增大后趨于平緩。當酒精度一定時，隨發(fā)酵溫度增大，醋酸含量先增大后減小。等高線密集，說明響應(yīng)值（醋酸含量）在試驗變化范圍內(nèi)存在極高值，交互影響作用顯著，與方差分析結(jié)果一致。

圖5中b為發(fā)酵溫度30℃時，酒精度和殘?zhí)呛繉Υ姿岷康慕换プ饔?。當酒精度一定時，醋酸含量隨時間升高先增大后趨平緩。當殘?zhí)呛恳欢〞r，醋酸含量隨酒精濃度的升高先增大后趨于平緩。響應(yīng)面顯示坡度較平緩，說明兩者交互作用不顯著。

圖5中c為酒精度6%時，發(fā)酵溫度和殘?zhí)呛繉Υ姿岷康慕换プ饔?。當發(fā)酵溫度一定時，醋酸含量隨壓力的升高先增大后趨于平緩；當殘?zhí)呛恳欢〞r，醋酸含量隨溫度升高先增大后減小，且響應(yīng)面顯示坡度較陡，等高線密集，表明發(fā)酵溫度和殘?zhí)呛拷换プ饔脴O顯著。

2.3.3 最佳條件的預(yù)測及驗證試驗

通過回歸模型的預(yù)測得到葡萄醋的最佳提取工藝為：酒精度為6.08%、溫度為30.51℃、殘?zhí)橇繛?4.86g/L，獲得醋酸含量為6.19g/dL。根據(jù)試驗操作的可行性，把工藝參數(shù)優(yōu)化為酒精度為6.0%、溫度為30.0℃、殘?zhí)橇繛?5.0g/L，在此條件下進行3次平行試驗驗證，醋酸含量為（6.17±0.08）g/dL，與理論預(yù)測值 6.19g/dL 誤差值僅為0.02g/dL（p＜0.05），證實了該模型的有效性。

3 小結(jié)

通過多次試驗得出，對葡萄醋醋酸含量起關(guān)鍵作用的因素主要是發(fā)酵溫度、酒精度和糖含量。采用單因素和響應(yīng)面試驗確定發(fā)酵最佳條件，結(jié)果表明酒精度為6.14%、溫度為32℃、糖含量為15.31g/L時，A.pasteurianusSP001產(chǎn)醋酸含量最高，其值為6.19g/dL。