丁　偉，牟鵬舉，Muhammad Shahid Khan,2

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱　150030；2.白沙瓦農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)系，巴基斯坦　白沙瓦　1599107）

城市生活污泥是污水處理過(guò)程中的沉積物，含有重金屬、病原微生物和有機(jī)污染物等有害物質(zhì)，對(duì)環(huán)境產(chǎn)生不利影響[1-2]。我國(guó)城市生活污泥產(chǎn)量日益增多，處理方式成為關(guān)注熱點(diǎn)[3]。

目前世界各國(guó)對(duì)污泥處理主要有3種方式：衛(wèi)生填埋、焚燒和農(nóng)業(yè)再利用。衛(wèi)生填埋是處理生活污泥普遍方法并被多數(shù)國(guó)家采用，然而此方法占地面積大且對(duì)地下水造成污染[4]。隨農(nóng)業(yè)技術(shù)進(jìn)步，發(fā)達(dá)國(guó)家如美國(guó)、英國(guó)等城市生活污泥填埋比例不斷下降，污泥用于農(nóng)業(yè)再利用增加[5]。與國(guó)外發(fā)達(dá)國(guó)家較高的污泥農(nóng)用率相比，我國(guó)污泥農(nóng)用率較低，衛(wèi)生填埋仍是處理污泥主要途徑[6-8]。城市生活污泥富含有機(jī)質(zhì)、氮、磷及微量元素等農(nóng)作物生長(zhǎng)必需營(yíng)養(yǎng)成分[9]，經(jīng)處理后城市生活污泥可用于在園林綠化和藥用植物栽培[10-11]。探索城市污泥再利用并降低環(huán)境危害，是解決污泥問題重要途徑[12-13]。

本文所用城市污泥腐殖土來(lái)自哈爾濱市，污泥經(jīng)腐熟制成的腐殖土是良好肥料和土壤改良劑[14]，但由于污泥腐殖土嚴(yán)重抑制作物種子萌發(fā)，限制腐殖土應(yīng)用。因此，分離并鑒定該腐殖土中活性抑制物質(zhì)對(duì)合理利用城市生活污泥具有重要意義。本文采用蒸餾水浸提法提取污泥腐殖土中粗物質(zhì)，再經(jīng)硅膠柱分離和紅外光譜鑒定粗提物抑制種子萌發(fā)活性物質(zhì)，為哈爾濱地區(qū)污泥合理利用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

2016年4月開始試驗(yàn)，城市污泥腐殖土由龍江環(huán)保集團(tuán)提供，試驗(yàn)儀器：便攜式紅外分析器，GXH-3010D，北京市電腦技術(shù)應(yīng)用研究所；色譜柱，SE-54，日本島津公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，RE-52AA，上海申勝生物技術(shù)有限公司；循環(huán)水式真空泵，SHB-Ⅲ，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2　方法

1.2.1城市污泥腐殖土活性物質(zhì)粗提取

城市污泥腐殖土活性物質(zhì)粗提物采用蒸餾水浸提法并用超聲波震蕩提高提取效率[15]，稱量腐殖土200 g于1 L容量瓶并加入800 mL蒸餾水，20℃，20 kHz充分震蕩1 h后0.22 μm超濾膜過(guò)濾，濾液經(jīng)1 ku透析袋透析72 h后收集粗提物，置于0℃冰箱備用。

1.2.2城市污泥腐殖土粗提物對(duì)種子萌發(fā)影響測(cè)定方法

種子萌發(fā)試驗(yàn)采用培養(yǎng)皿法，25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[16]。選取均一水蘿卜、小白菜及油菜種子，2%次氯酸鈉溶液消毒種子，清水沖洗3次。設(shè)6個(gè)處理，3次重復(fù)，每個(gè)鋪有雙層濕潤(rùn)濾紙培養(yǎng)皿中放入50粒供試種子，每個(gè)處理各倒入20 mL供試溶液（見表1）。調(diào)查不同時(shí)間種子發(fā)芽數(shù)，計(jì)算各處理種子發(fā)芽率。

表1　供試腐殖土活性粗提物濃度Table 1　Solution concentration of substances in humus soil

1.2.3城市污泥腐殖土粗提物對(duì)植物抗逆酶影響

供試植物為玉米，選擇種子萌發(fā)試驗(yàn)中抑制種子萌發(fā)作用較強(qiáng)濃度噴施莖葉[17]，5次重復(fù)。選顆粒飽滿、尺寸一致玉米種子，經(jīng)消毒、浸種處理后播種于直徑9 cm塑料營(yíng)養(yǎng)缽。出苗后第10天，按每平方米面積50 mL污泥活性物質(zhì)溶液莖葉噴霧處理，以清水為對(duì)照，施藥后7、14、21 d測(cè)定玉米生長(zhǎng)指標(biāo)及抗氧化酶活性。

1.2.3.1超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定

酶液提?。悍Q取玉米第一片葉0.5 g置于預(yù)冷研缽中，加2 mL預(yù)冷pH 7.8磷酸緩沖液，加入少量石英砂研磨勻漿，緩沖液定容至終體積8 mL，4℃7 000 r·min-1離心20 min，上清液即為SOD粗提液。

活性測(cè)定：酶活性測(cè)定采用分光光度比色法，以抑制NBT光化還原反應(yīng)50%為1個(gè)超氧化物酶活力單位（U）[18]。

1.2.3.2過(guò)氧化物酶（POD）活性測(cè)定

酶液提?。喝?.5 g待測(cè)葉片放入研缽中，加入pH 5.5磷酸緩沖溶液5 mL，研磨勻漿，4℃8 000 r·min-1離心15 min，上清液即為過(guò)氧化物酶粗提液。

活性測(cè)定：過(guò)氧化物酶活性測(cè)定采用分光光度比色法，以每分鐘內(nèi)A470變化0.01為1個(gè)過(guò)氧化物酶活性單位（U）[18]。

1.2.3.3過(guò)氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定

酶液提?。悍Q取玉米葉片樣品0.5 g，加入pH 7.8磷酸緩沖溶液5 mL，研磨勻漿，轉(zhuǎn)移到離心管中，定容到8 mL。4 ℃ 4 000 r·min-1離心15 min，上清液即為過(guò)氧化氫酶粗提液。

活性測(cè)定：過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定采用分光光度比色法，以每分鐘A240吸光度值減少0.01為1個(gè)酶活性單位（U）[18]。

1.2.3.4苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性測(cè)定

酶液提?。悍Q取玉米葉片樣品0.5 g，加入少量石英砂，吸取4 mL硼酸緩沖液（pH 8.8，含5 mmol·L-1巰基乙醇），于研缽中磨勻漿，轉(zhuǎn)移至離心管中，以硼酸緩沖液稀釋到8 mL，10 000 r·min-1離心15 min，取出置于冰水浴中，上清液供測(cè)定酶活使用。

活性測(cè)定：苯丙氨酸解氨酶活性測(cè)定采用分光光度比色法，以每分鐘A290吸光度值變化0.01為1個(gè)酶活單位（U）[19]。

1.2.3.5肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）活性測(cè)定

酶液提?。悍Q取玉米葉片樣品0.5 g，加入提取液研磨勻漿后移到離心管中，稀釋到8 mL。提取液組成為：pH 8.9 50 mmo·L-1Tris-HCl，15 mmo·L-1β-巰基乙醇，4 mmo?L-1MgCl2，5 mmo·L-1VC，10 μmol?L-1Leupeptin 亮肽素，1 mmo·L-1PMSF，0.15%PVP（W/V），10%甘油。4℃ 10 000 r·min-1離心20 min。取上清液為C4H粗酶提取液。

活性測(cè)定：肉桂酸-4-羥基化酶活性測(cè)定采用分光光度比色法。以每分鐘A340吸光度值變化0.01為一個(gè)酶活性單位（U）[19]。

1.2.3.64-香豆酸-輔酶A連接酶（4CL）活性測(cè)定

酶液提取：稱取玉米葉片樣品0.5 g，加入提取液研磨勻漿后轉(zhuǎn)移到離心管中，稀釋到6 mL。提取液組成為：pH 8.9 50 mmo·L-1Tris-HCl，15 mmo?L-1β-巰基乙醇，4 mmo?L-1MgCl2，5 mmo?L-1VC，10 μmol·L-1Leupeptin 亮肽素，1 mmo·L-1PMSF，0.15%PVP（W/V），10%甘油。4℃ 10 000 r?min-1離心20 min。取上清液為4CL粗酶提取液。

活性測(cè)定：4-香豆酸-輔酶A連接酶活性測(cè)定采用分光光度比色法。以每分鐘A333吸光度值變化0.0001為一個(gè)酶活性單位（U）[19]。

1.2.4城市污泥腐殖土活性物質(zhì)分離與鑒定

2.3 g城市污泥腐殖土粗提物研磨成粉并置于200 mL蒸餾水中，完全溶解后加入80～100目硅膠5 g。粗提取物與硅膠混合均勻后60℃水浴攪拌，蒸發(fā)水分至15%，置于干燥器內(nèi)冷卻至室溫后得樣品硅膠。稱150 g 200～300硅膠作分離膠，然后把干燥樣品膠加入柱內(nèi)，頂部置一層薄脫脂棉，3倍柱體積蒸餾水打通硅膠柱。薄層層析法（TLC）選擇洗脫劑，硅膠板以硅膠254為載體選擇不同洗脫溶劑，供試洗脫劑分別為：乙酸乙酯-乙醇-水，正丁醇-酒精-水，正丁醇-醋酸-水，根據(jù)TLC的Rf值選擇洗脫液，以正丁醇-酒精-水為展開劑洗脫[20-21]。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)確定正丁醇∶酒精∶水為9∶1∶1，每15 mL收集一份洗脫液。薄層展開后254 nm紫外燈光照確定斑點(diǎn)位置，計(jì)算比移值Rf，合并相同餾分并對(duì)餾分作活性跟蹤試驗(yàn)。干物質(zhì)中活性物質(zhì)經(jīng)紅外光譜檢測(cè)后結(jié)合官能團(tuán)紅外吸收特征頻率表，確定化合物結(jié)構(gòu)。

1.2.5城市污泥腐殖土活性物質(zhì)作用機(jī)理測(cè)試方法

供試種子為水稻，分離獲得活性物質(zhì)處理種子，淀粉酶含量測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸法[22]。

2　結(jié)果與分析

2.1　城市污泥腐殖土粗提物對(duì)種子萌發(fā)影響

城市污泥腐殖土粗提物處理水蘿卜種子，發(fā)芽率受明顯抑制。36 h內(nèi)，200倍和400倍液處理種子萌發(fā)率分別為43.34%和57.34%，600倍液液以上種子發(fā)芽率較高，達(dá)88.66%～96.66%，72 h后發(fā)芽率與對(duì)照比無(wú)明顯差異，而200倍液處理下種子發(fā)芽率僅為57.34%，仍受顯著抑制，結(jié)果如表2所示。

表2　提取物對(duì)水蘿卜發(fā)芽率影響Table 2　Effect of extract on the germination rate of radish （%）

小白菜發(fā)芽試驗(yàn)表明，200倍和400倍液下種子發(fā)芽率72 h內(nèi)均顯著降低，36 h內(nèi)發(fā)芽率分別為50.7%和63.3%，說(shuō)明種子發(fā)芽勢(shì)也受顯著影響。600至1 000倍濃度條件下，48 h種子發(fā)芽率達(dá)83.3%以上，72 h發(fā)芽率達(dá)90%以上。隨粗提物稀釋倍數(shù)增高，小白菜種子發(fā)芽率增高，但200～400倍液濃度下，種子發(fā)芽勢(shì)受顯著抑制，其中以200倍液處理種子發(fā)芽率最低，結(jié)果如表3所示。

油菜種子發(fā)芽試驗(yàn)表明，經(jīng)粗提物處理油菜種子，發(fā)芽率明顯受到抑制。36 h內(nèi)200倍和400倍液處理種子，其發(fā)芽率分別為57.7%和63.3%，除對(duì)照組外，其他濃度處理組發(fā)芽率達(dá)80%以上。72 h后除200倍液外發(fā)芽率均90%以上。隨粗提物稀釋倍數(shù)增高，油菜種子發(fā)芽率增高，其中以200倍液處理種子發(fā)芽率最低，抑制效果最顯著，結(jié)果如表4所示。

表3　提取物對(duì)小白菜發(fā)芽率影響Table 3　Effect of extracts on the germination rate of Chinese cabbage （%）

表4　提取物對(duì)油菜發(fā)芽率影響Table 4　Effect of extracts on the germination rate of rape （%）

2.2　城市污泥腐殖土粗提物對(duì)植物超氧物歧化酶（SOD）活性影響

200倍和400倍粗提液處理玉米植株SOD活性顯著高于對(duì)照，200倍液SOD在施藥后第14天達(dá)最高值后開始降低。400倍液處理SOD變化與對(duì)照規(guī)律一致，表現(xiàn)為先降后升，但SOD活性始終顯著高于對(duì)照，結(jié)果如圖1所示。

2.3　城市污泥腐殖土粗提物對(duì)植物過(guò)氧化物酶（POD）活性影響

粗提物200倍液和400倍液處理后玉米幼苗中POD活性均顯著提高，且峰值出現(xiàn)在施藥后第14天，酶活性分別較對(duì)照高32.86%和28.03%。14 d至21 d植株中POD活性雖然一定程度降低，但仍明顯高于對(duì)照。表明隨粗提物濃度升高，玉米幼苗中POD活性升高，以200倍液對(duì)玉米植株P(guān)OD活性抑制作用最大，結(jié)果如圖2所示。

2.4　城市污泥腐殖土粗提物對(duì)植物過(guò)氧化氫酶（CAT）活性影響

粗提物200倍液和400倍液處理后玉米幼苗中CAT活性均顯著提高，施藥14 d后達(dá)抑制峰值，且200倍液處理植株幼苗中CAT活性顯著高于400倍液。14～21 d各處理CAT活性呈下降趨勢(shì)，但200倍液和400倍液處理植株中CAT活性仍顯著高于對(duì)照組。表明隨污泥活性提取物濃度升高，玉米幼苗中CAT活性增強(qiáng)，200倍液對(duì)玉米植株有明顯抑制作用，結(jié)果如圖3所示。

圖1　提取物對(duì)玉米幼苗SOD活性影響Fig.1　Effect of extract on maize seedling SOD activity

圖2　提取物對(duì)玉米幼苗POD活性影響Fig.2　Effect of extract on maize seedling POD activity

圖3　提取物對(duì)玉米幼苗CAT活性影響Fig.3　Effect of extract on maize seedling CAT activity

2.5　城市污泥腐殖土粗提物對(duì)植物苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性影響

粗提物200倍液和400倍液處理玉米植株，其體內(nèi)PAL酶活性顯著高于對(duì)照。出苗14 d達(dá)抑制峰值。14～21 d粗提物200倍液和400倍液處理玉米植株體內(nèi)PAL活性呈下降趨勢(shì)，但活性仍高于對(duì)照。由此可知，當(dāng)玉米植株受城市污泥腐殖粗提物刺激時(shí)，體內(nèi)PAL酶活性增強(qiáng)，粗提物對(duì)玉米植株產(chǎn)生脅迫作用，結(jié)果如圖4所示。

2.6　城市污泥腐殖土粗提物對(duì)植物肉桂酸-4氫化酶的(C4H)活性影響

粗提物200倍液和400倍液處理玉米植株，其體內(nèi)C4H活性顯著高于對(duì)照。施藥后14 d達(dá)抑制峰值，且200倍液處理植株體內(nèi)C4H活性顯著高于400倍液。14～21 d，粗提物200倍液處理植株體內(nèi)C4H活性降低，400倍液處理植株體內(nèi)C4H活性上升，但兩者C4H活性仍高于對(duì)照。由此可知，經(jīng)粗提物處理玉米植株體內(nèi)C4H酶活性增強(qiáng)，粗提物對(duì)玉米植株產(chǎn)生脅迫作用，結(jié)果如圖5所示。

2.7　城市污泥腐殖土粗提物對(duì)植物4-香豆酸-輔酶A連接酶(4CL)活性影響

經(jīng)粗提物200倍液和400倍液處理玉米植株，出苗14 d其體內(nèi)C4H活性均顯著高于對(duì)照，出苗21 d達(dá)抑制峰值，體內(nèi)C4H活性分別較對(duì)照高34.44%和9.10%，且200倍液處理組玉米體內(nèi)4CL酶活性顯著高于400倍液。說(shuō)明隨污泥活性提取物濃度增大，玉米體內(nèi)4CL酶活性上升，200倍液粗提物對(duì)玉米植株有顯著抑制作用，如圖6所示。

圖4　提取物對(duì)玉米幼苗PAL活性影響Fig.4　Effect of extract on maize seedling PAL activity

圖5　提取物對(duì)玉米幼苗C4H活性影響Fig.5　Effect of extract on maize seedling C4H activity

圖6　提取物對(duì)玉米幼苗4CL活性影響Fig.6　Effect of extract on maize seedling 4CL activity

2.8　城市污泥腐殖土粗提物中活性物質(zhì)分離情況

種子萌發(fā)試驗(yàn)確定200倍液腐殖土活性粗提物對(duì)小白菜和水蘿卜種子萌發(fā)抑制作用較強(qiáng)。因此，以200倍液腐殖土活性粗提物為供試溶液。薄層色譜法選擇洗脫劑，以正丁醇∶酒精∶水為9∶1∶1體系作為洗脫劑效果最好。餾分1的Rf為0.65，其他均為0.59，合并相同餾分并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑，結(jié)果如表5、圖7所示。

表5　硅膠分離提取物Rf值Table 5　Rfvalue of the extract by silica gel column

圖7　硅膠分離提取物TLC圖譜Fig.7　TLC of the extract by silica gel column

2.9　城市污泥腐殖土活性物質(zhì)對(duì)水稻種子發(fā)芽和α-淀粉酶活性影響

對(duì)兩個(gè)餾分作活性跟蹤試驗(yàn)并測(cè)定其效果，36 h對(duì)照種子發(fā)芽率為100%，餾分1和餾分2處理后水稻種子發(fā)芽率分別為34%和90%，至72 h餾分1處理后水稻種子萌發(fā)率僅為42%?？梢姡s分1對(duì)水稻種子具有明顯抑制作用（見表6）。制備各濃度麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，并在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.1681x-0.1549，R2=0.9956，如圖8所示。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算對(duì)照組及餾分1的α-淀粉酶活力，結(jié)果如表7所示。α-淀粉酶活力與種子發(fā)芽率呈顯著正相關(guān)，餾分1處理水稻種子α-淀粉酶活性及種子發(fā)芽率均顯著降低，表明腐殖土中3-羥基苯甲酸通過(guò)影響α-淀粉酶活性顯著降低水稻種子發(fā)芽率。

表6　餾分對(duì)水稻種子萌發(fā)率影響Table 6　Effects of distillates on rice seed germination rate （%）

圖8　麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8　Maltose standard curve

表7　活性物質(zhì)對(duì)α-淀粉酶活性影響Table 7　Effects of active substances on a-amylase activity

圖9　提提取物紅外(IR)譜圖Fig.9　IR of extract

2.10　城市污泥腐殖土活性物質(zhì)鑒定

對(duì)餾分1作紅外光譜檢測(cè)，波數(shù)3 420 cm-1對(duì)應(yīng)羥基O-H伸縮振動(dòng)吸收峰，波數(shù)2 953 cm-1對(duì)應(yīng)苯環(huán)=C-H不飽和伸縮振動(dòng)峰，波數(shù)1 080 cm-1對(duì)應(yīng)C=C不對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰，波數(shù)1 702 cm-1對(duì)應(yīng)C=O羰基伸縮振動(dòng)峰，波數(shù)788 cm-1對(duì)應(yīng)苯環(huán)-C=H面外彎曲并有三個(gè)相鄰氫。結(jié)合紅外數(shù)據(jù)鑒定餾分中含有化合物3-羥基苯甲酸，結(jié)果見圖9、10。

圖10　活性提取物分子結(jié)構(gòu)Fig.10　Molecular structure of the active extract

3　討論與結(jié)論

目前污泥中己提取生物活性物質(zhì)包括腐植酸、氨基酸、維生素、生長(zhǎng)素，其中腐植酸和生長(zhǎng)素對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆性影響顯著[23-24]。城市污泥處理后形成腐殖土中含有抑制種子發(fā)芽活性物質(zhì)。吳鳳芝等研究表明，黃瓜連作土壤中含羥基苯甲酸類物質(zhì)，此類化合物處理黃瓜幼苗后抗逆酶POD、CAT活性顯著升高，表明羥基苯甲酸類物質(zhì)對(duì)植物生長(zhǎng)有抑制作用[25]。本研究采用透析旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法分離污泥腐殖土粗提物，利用薄層層析和柱層析結(jié)合紅外光譜對(duì)粗提物純化和初步結(jié)構(gòu)鑒定，獲得活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)為3-羥基苯甲酸，隨含有該化合物腐殖土粗提取物濃度增加，供試植株體內(nèi)SOD、POD、CAT、PAL、C4H及4CL活性增高，表明該化合物對(duì)植株生長(zhǎng)產(chǎn)生脅迫作用，與吳鳳芝等研究結(jié)果基本一致。王璞等利用羥基苯甲酸浸種試驗(yàn)表明，高濃度羥基苯甲酸類物質(zhì)顯著降低棉花種子發(fā)芽率，種子生長(zhǎng)受顯著抑制[26]，但未明確羥基苯甲酸類物質(zhì)作用機(jī)理。α-淀粉酶是水稻種子萌發(fā)初期最重要水解酶，胚乳中碳水化合物在α-淀粉酶作用下轉(zhuǎn)化為糖，為胚提供形成新組織原料和發(fā)芽能量[27]。本文初步鑒定污泥腐殖土提取物活性物質(zhì)為3-羥基苯甲酸，隨該物質(zhì)濃度增加，供試種子發(fā)芽率下降，種子萌發(fā)受抑制，時(shí)間延長(zhǎng)，且證實(shí)該化合物對(duì)水稻種子發(fā)芽過(guò)程中α-淀粉酶活性產(chǎn)生顯著抑制，是影響種子正常萌發(fā)、導(dǎo)致發(fā)芽率明顯降低重要機(jī)制。