范學(xué)哲，王　靜，張艷君， 張　業(yè)

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院, 北京 100005)

神經(jīng)細(xì)胞形成是復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程，在神經(jīng)分化模型中研究其調(diào)控機(jī)制簡(jiǎn)化了神經(jīng)分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究復(fù)雜度，atRA誘導(dǎo)P19細(xì)胞分化模型是目前研究神經(jīng)分化的成熟模型之一[1-2]。組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾維持正常神經(jīng)分化過(guò)程，研究組蛋白修飾是研究表觀遺傳在神經(jīng)分化過(guò)程中的功能最主要的方式之一[3-4]。曲古抑菌素(trichostatin A,TSA)是特異的Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)組蛋白去乙?；敢种苿5]，但它無(wú)法抑制第Ⅲ類(lèi)組蛋白的去乙酰化酶活性，煙酰胺(nicotinamide,NAM)可抑制Ⅲ類(lèi)組蛋白去乙?；富钚訹6]。腺苷二醛(adenosine dialdehyde,AdOx)是甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑[7]。利用組蛋白修飾抑制劑研究組蛋白修飾對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的影響已成為研究表觀遺傳機(jī)制的高效手段。LncRNA Neat1在神經(jīng)興奮中起重要作用，其表達(dá)量依賴(lài)于神經(jīng)興奮性[8]。但LncRNA Neat1在神經(jīng)分化過(guò)程中的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究LncRNA Neat1表達(dá)量在atRA誘導(dǎo)P19分化的過(guò)程中變化，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)組蛋白修飾對(duì)于Neat1表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1試劑：α-MEM(Gibco公司)；胎牛血清(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所)；Trizol(Invitrogen公司)；RNAVzol(Vigofect公司)；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和RNase-free DNase Ⅰ(Promega公司)；SYBR Premix Ex Taq、Ribonuclease Inhibitor、dNTP(TaKaRa公司)。

1.1.2藥物：全反式維全酸(atRA)、腺苷二醛(AdOx)、古柳抑菌素(TSA)、煙酰胺(NAM)(Sigma-Aldrich公司)。

1.1.3細(xì)胞：小鼠畸胎瘤細(xì)胞P19細(xì)胞系(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)。

1.2　方法

1.2.1P19細(xì)胞培養(yǎng)及atRA誘導(dǎo)分化:在含10%胎牛血清的α-MEM完全培養(yǎng)基，5% CO2、37 ℃條件下貼壁培養(yǎng)小鼠畸胎瘤細(xì)胞系P19，將培養(yǎng)的P19細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，以1×105個(gè)/mL細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，24 h后，利用含終濃度0.5 μmol/L atRA的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。4 d后，將成團(tuán)的細(xì)胞用胰蛋白酶消化，重新吹散，接種于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，明場(chǎng)觀察并拍照記錄。

1.2.2RNA提取和反轉(zhuǎn)錄:利用預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞2次，加入1 mL Trizol吹打至不再黏稠，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，室溫放置5 min，隨后利用酚/氯仿抽提的方法提取RNA，利用30 μL無(wú)RNase ddH2O溶解RNA，并利用Nanodrop檢測(cè)RNA純度，隨后取2 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照Promega試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.2.3實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)：以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用優(yōu)化后的引物(表1)在qPCR儀器上進(jìn)行qPCR檢測(cè)，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 1 min; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 15 s, 72 ℃ 20 s; 40個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。樣品的相對(duì)表達(dá)量(內(nèi)參為GAPDH)利用2-△△Ct方法進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4細(xì)胞的藥物處理:將正常培養(yǎng)的P19細(xì)胞分別用含不同濃度TSA、NAM、AdOx的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，隨后收取細(xì)胞，提取RNA，RT-qPCR檢測(cè)Neat1的表達(dá)(引物序列見(jiàn)表1)。

表1　引物序列Table 1　Sequence of primers

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphPad Prism6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，利用t檢驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)間差異性。

2　結(jié)果

2.1　atRA誘導(dǎo)P19神經(jīng)分化模型的建立

利用atRA誘導(dǎo)P19細(xì)胞，4 d后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞明顯成團(tuán)聚集，細(xì)胞貼壁性降低，撤掉atRA(atRA-)繼續(xù)培養(yǎng)4 d形成神經(jīng)元樣細(xì)胞(圖1A)。神經(jīng)細(xì)胞的分子標(biāo)志物Mash1的mRNA隨誘導(dǎo)時(shí)間增加而升高(圖1B)，表明神經(jīng)分化模型成功建立。

2.2　atRA誘導(dǎo)的P19細(xì)胞分化引起LncRNA Neat1表達(dá)顯著升高

LncRNA Neat1的表達(dá)隨著atRA誘導(dǎo)P19細(xì)胞時(shí)間增加而升高，誘導(dǎo)4 d后，Neat1的表達(dá)量比未誘導(dǎo)組顯著升高(圖2)。

A.morphological changes of P19 cells during differentiation(×400); B.the expression ofMash1 mRNA detected with RT-qPCR assay;*P<0.01，**P<0.001，***P<0.0001 compared with control(0 day)

*P<0.01，**P<0.001 compared with control(0 day)圖2　LncRNA Neat1在atRA誘導(dǎo)P19分化中的表達(dá)Fig 2　Expression of LncRNA Neat1 in atRA-induced

2.3　去乙?；敢种苿㏕SA促進(jìn)Neat1的表達(dá)

利用不同的組蛋白修飾酶的抑制劑處理P19細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TSA處理后P19細(xì)胞Neat1的表達(dá)隨藥物濃度的增加顯著上調(diào)(圖3A)，而NAM和AdOx處理P19細(xì)胞，Neat1的表達(dá)并無(wú)顯著變化(圖3B,C)。

3　討論

目前關(guān)于Neat1的研究局限于Neat1在神經(jīng)興奮以及癌中的作用，本研究首先發(fā)現(xiàn)在atRA誘導(dǎo)P19分化的過(guò)程中LncRNA Neat1的表達(dá)顯著上調(diào)。已有研究表明Neat1在神經(jīng)興奮傳導(dǎo)過(guò)程中十分重要。在神經(jīng)分化的過(guò)程中，Neat1的上調(diào)是神經(jīng)發(fā)育中必要的過(guò)程。其次，本研究利用組蛋白修飾相關(guān)表觀遺傳因子的抑制劑檢測(cè)組蛋白修飾對(duì)Neat1表達(dá)的影響，結(jié)果顯示組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA處理后，Neat1的表達(dá)上調(diào),表明Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)組蛋白去乙酰化酶導(dǎo)致的組蛋白去乙?；癄顟B(tài)抑制Neat1表達(dá)。然而，NAM作為第Ⅲ類(lèi)組蛋白去乙酰化酶抑制劑卻沒(méi)有顯著影響Neat1的表達(dá)，表明第Ⅲ類(lèi)組蛋白去乙?；富钚圆粎⑴cNeat1的表達(dá)調(diào)控。同時(shí)甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑AdOx也沒(méi)有影響Neat1的表達(dá)，表明組蛋白甲基化水平對(duì)于Neat1的調(diào)控沒(méi)有明顯的作用， 本研究首先建立了組蛋白修飾和Neat1表達(dá)之間的關(guān)系，為Neat1的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

Expression of Neat1 in P19 cells treated with TSA (A), NAM(B) and AdOx(C);*P<0.05,**P<0.01 compared with control

TSA對(duì)于Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)組蛋白組去乙酰化酶均有抑制作用，TSA處理細(xì)胞后，細(xì)胞整體的組蛋白乙?；綄⑸仙５?，Neat1的啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白乙酰化狀態(tài)依然不清晰。研究Neat1在分化過(guò)程中啟動(dòng)子區(qū)的組蛋白修飾狀態(tài)將為Neat1的調(diào)節(jié)機(jī)制提供根據(jù)。

組蛋白的多樣化修飾參與基因表達(dá)的精準(zhǔn)調(diào)控。如組蛋白磷酸化參與激活增殖相關(guān)的基因，組蛋白泛素化一般參與基因表達(dá)的抑制等，此研究利用組蛋白的乙?；约凹谆瘜?duì)Neat1表達(dá)的影響，對(duì)于其他類(lèi)型的組蛋白修飾對(duì)Neat1表達(dá)的影響依然未知，本研究為進(jìn)一步研究組蛋白修飾的類(lèi)型對(duì)Neat1表達(dá)的影響打下基礎(chǔ)。

已有研究發(fā)現(xiàn)P53可通過(guò)促進(jìn)Neat1的表達(dá)從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，并且Neat1的高表達(dá)能夠?qū)е缕つw癌，Neat1敲除的小鼠能夠抵抗化學(xué)誘導(dǎo)的皮膚癌。該研究為Neat1的潛在表觀調(diào)節(jié)機(jī)制提供依據(jù)，可通過(guò)篩選能夠調(diào)節(jié)Neat1表達(dá)的組蛋白修飾相關(guān)的表觀遺傳因子抑制劑，為癌的治療提供潛在的靶點(diǎn)。