吳克堅(jiān)　趙清波　李嬋娟　王　陵　李　晨　潘海濤　夏結(jié)來(lái)△

【提　要】　目的　在生物類似藥的質(zhì)量比對(duì)研究中，為評(píng)價(jià)候選藥與參照藥的分析相似性，F(xiàn)DA建議對(duì)3個(gè)不同層級(jí)的關(guān)鍵質(zhì)量屬性采用不同的評(píng)價(jià)方法。本文建立第1層級(jí)的關(guān)鍵質(zhì)量屬性分析相似性評(píng)價(jià)的步驟及方法，重點(diǎn)討論如何確定候選藥與參照藥的樣本量nT,nR。方法　利用判斷方差齊性的F檢驗(yàn)介紹方差相似性檢驗(yàn)假設(shè)及統(tǒng)計(jì)量的建立；利用高個(gè)體差異藥物的生物等效性評(píng)價(jià)方法及雙單側(cè)檢驗(yàn)的性質(zhì)等建立分析相似性檢驗(yàn)假設(shè)及統(tǒng)計(jì)量，并由推導(dǎo)得到的檢驗(yàn)效能的精確公式確定樣本量。結(jié)果　在分析相似性評(píng)價(jià)過(guò)程中將nR控制在[nT,1.5nT]內(nèi)，根據(jù)數(shù)值模擬得到不同參數(shù)組合的樣本量，提出了確定nT,nR的策略，在此基礎(chǔ)上給出了評(píng)價(jià)生物類似藥分析相似性的具體步驟和方法。結(jié)論　本文提出的樣本量確定策略及評(píng)價(jià)分析相似性的步驟與方法可應(yīng)用到實(shí)際的分析相似性研究中；同時(shí)由推導(dǎo)得到的檢驗(yàn)效能精確公式還可獲得其他參數(shù)組合的樣本量。

自上世紀(jì)80年代開(kāi)始，生物藥陸續(xù)上市，比如生長(zhǎng)激素、細(xì)胞因子、重組單克隆抗體等，它們?cè)谝恍┐x性疾病、腫瘤、自身免疫性疾病等領(lǐng)域中顯示出了明顯的臨床價(jià)值。近年來(lái)，隨著原研生物藥的專利到期或即將到期，越來(lái)越多的藥企加入到生物類似藥的研發(fā)行列中，為患者提供與原研藥在質(zhì)量、安全性和有效性上高度相似的生物類似藥，滿足患者的用藥需求，降低醫(yī)療成本[1]；比如美國(guó)生物制藥公司輝瑞(Pfizer)和韓國(guó)生物制品制造商Celltrion共同開(kāi)發(fā)的英夫利昔單抗的生物類似藥Inflectra比其品牌藥Remicade價(jià)格低15%，并有文獻(xiàn)指出在一項(xiàng)調(diào)查研究中的患者使用該生物類似藥每年可節(jié)約醫(yī)療成本約19%[2]。

生物類似藥相對(duì)分子質(zhì)量較大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有獨(dú)特的免疫原性和活性的安全隱患，給研發(fā)和監(jiān)管帶來(lái)了相當(dāng)大的挑戰(zhàn)；并且它不同于小分子化學(xué)仿制藥的有機(jī)合成，非“生物仿制藥”，故傳統(tǒng)的證明仿制藥與參照藥生物等效的方法并不能直接適用于生物類似藥[3]。因此，許多監(jiān)管機(jī)構(gòu)都發(fā)布了相關(guān)的指南文件或技術(shù)規(guī)范，如歐洲藥品管理局(EMA)、美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)、世界衛(wèi)生組織(WHO)等[4-6]。我國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)也于2015年3月發(fā)布了《生物類似藥研發(fā)與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》，其中明確了生物類似藥的定義，提出了生物類似藥研發(fā)和評(píng)價(jià)的基本原則，包括藥學(xué)、非臨床及臨床研究和評(píng)價(jià)等內(nèi)容[7]。然而隨著生物制藥公司對(duì)研發(fā)生物類似藥的興趣日漸濃厚，生物類似藥的品種越來(lái)越多，上述指導(dǎo)原則或技術(shù)規(guī)范顯得不夠詳細(xì)，有些具體的要求及細(xì)節(jié)未能面面俱到。因此，國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者討論了很多具體的統(tǒng)計(jì)方法，比如分析相似性的評(píng)價(jià)方法、樣本量(批次)估計(jì)、如何全面獲得原研藥質(zhì)量參數(shù)等[8-10]；再如，討論證明療效高度相似的統(tǒng)計(jì)方法[11]以及生物類似藥貝葉斯自適應(yīng)的臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法[12]等。

FDA在發(fā)布的闡述生物類似藥審批流程的3個(gè)指南文件草案表示，對(duì)注冊(cè)申請(qǐng)生物類似藥的全部提交資料采用“證據(jù)鏈完備性(totality-of-evidence)”的方法來(lái)審查，并鼓勵(lì)用“逐步遞進(jìn)法(stepwise)”來(lái)分階段證明其與參照藥的相似性，并在后續(xù)的研發(fā)步驟中設(shè)法解決兩者的差異。證據(jù)鏈完備性的方法形如“金字塔”，處于第1層的是質(zhì)量比對(duì)研究，處于最高層的是臨床相似性研究[13]。質(zhì)量比對(duì)研究是指采用適合的、最先進(jìn)的分析檢測(cè)方法對(duì)候選藥及參照藥開(kāi)展全面的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)功能、生物活性、雜質(zhì)和純度等方面的研究，然后進(jìn)行頭對(duì)頭比較以說(shuō)明候選藥與參照藥在各質(zhì)量參數(shù)上是否相似。因此逐步遞進(jìn)法始于質(zhì)量參數(shù)的分析相似性研究。例如FDA批準(zhǔn)山德士公司(Sandoz)的生物類似藥Zarxio(參照藥為安進(jìn)藥物Neupogen)；再如FDA批準(zhǔn)的首個(gè)阿達(dá)木單抗生物類似藥Amjevita(ABP501)(參照藥為修美樂(lè)Humira)，由美國(guó)生物制藥公司安進(jìn)(Amgen)研發(fā)，都對(duì)它們與其參照藥在一級(jí)結(jié)構(gòu)、高級(jí)結(jié)構(gòu)、純度、糖基化、生物活性等層面進(jìn)行了系統(tǒng)、充分的分析相似性評(píng)價(jià)[14-15]。

質(zhì)量比對(duì)研究是生物類似藥研發(fā)的必經(jīng)之路，也是簡(jiǎn)化非臨床和臨床研究的基礎(chǔ)。Chow,Tsong與Dong等人重點(diǎn)討論了此階段分析相似性評(píng)價(jià)方法、界值確定等問(wèn)題，并給出了檢驗(yàn)效能1-β及樣本量的計(jì)算方法[10,16-19]。生物類似藥成分和結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，同一批次的生物藥在不同的環(huán)境和條件下即使采用相同原理的分析檢測(cè)方法可能得到不同的結(jié)果；或者不同批次生物藥的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)常存在差異，因此有必要將候選藥與參照藥的變異都考慮進(jìn)來(lái)。然而上述文獻(xiàn)未納入這個(gè)重要的因素，沒(méi)有經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析假定候選藥與參照藥的總體方差相等，這樣可能會(huì)導(dǎo)致得到的相似性結(jié)論不準(zhǔn)確。同時(shí)根據(jù)我們?cè)谒幤髮?shí)地調(diào)研的結(jié)果，由于費(fèi)用成本等問(wèn)題，在實(shí)際的質(zhì)量比對(duì)研究階段候選藥的生產(chǎn)批次和參照藥的獲取批次都非常有限；且常常需要較多批次的參照藥以全面了解其理化及生物學(xué)性質(zhì)；這時(shí)會(huì)造成兩者樣本量的嚴(yán)重不對(duì)等。Dong等人討論了這一情況，指出當(dāng)NR>1.5NT時(shí)需要調(diào)整樣本量(NR,NT分別表示實(shí)際可獲得的參照藥與候選藥的批次)，給出了具體的調(diào)整方法[19]。然而當(dāng)NT

本文大致結(jié)構(gòu)如下：首先介紹基于質(zhì)量屬性分級(jí)體系的統(tǒng)計(jì)分析方法；其次討論評(píng)估第1層級(jí)的關(guān)鍵質(zhì)量屬性的分析相似性方法，通過(guò)推導(dǎo)得出的檢驗(yàn)效能精確公式計(jì)算樣本量；最后數(shù)值模擬各種參數(shù)組合下的樣本量方案，給出包括樣本量確定策略在內(nèi)的分析相似性評(píng)價(jià)方法的主要步驟，并結(jié)合實(shí)例分析進(jìn)行說(shuō)明。

方　　法

通過(guò)對(duì)生物藥結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)等方面的分析測(cè)定，我們可以得到一系列關(guān)鍵質(zhì)量屬性(critical quality attributes,CQAs)，它們以不同的數(shù)據(jù)類型反映生物藥的生物學(xué)活性、體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)、體內(nèi)藥效、免疫原性等特征，或多或少地影響著臨床效果。由于CQAs數(shù)量很多，所以FDA建議根據(jù)其關(guān)鍵程度及作用機(jī)理，或者通盤(pán)考慮、驗(yàn)證研究，建立3個(gè)層級(jí)的CQAs分級(jí)體系，然后使用不同的方法來(lái)進(jìn)行分析相似性評(píng)價(jià)。

如果某些CQAs直接影響臨床效果、產(chǎn)品質(zhì)量及安全性，或直接表明首要作用機(jī)制，我們將其歸到第1層級(jí)。比如生物類似藥Zarxio第1層級(jí)的CQAs有4個(gè)：氨基酸序列、效價(jià)、靶點(diǎn)結(jié)合力和蛋白濃度[16]。第1層級(jí)的CQAs是分析相似性研究中的重點(diǎn)，是判斷質(zhì)量可比性的重要基礎(chǔ)，采用類似于等效檢驗(yàn)(equivalence test)的評(píng)價(jià)方法。

由于第1層級(jí)的CQAs直接影響臨床效果，在分析相似性中最為重要，要求的統(tǒng)計(jì)方法最為嚴(yán)格，所以本文主要討論第1層級(jí)CQAs分析相似性的評(píng)價(jià)步驟與方法。首先我們進(jìn)行總體方差相似性檢驗(yàn)，經(jīng)檢驗(yàn)若認(rèn)為候選藥與參照藥在該CQA的總體方差是相似的，則接著進(jìn)行分析相似性檢驗(yàn)。具體如下：

1．方差相似性檢驗(yàn)

(1)

其中(ωL,ωU)是方差相似性界值，界值有很多選擇，如(0.67,1.5)、(0.5,1.5)等。在這里我們將界值設(shè)置得寬泛一些，為(0.5,2)。方差相似性檢驗(yàn)假設(shè)(1)可以分解為雙單側(cè)檢驗(yàn)(two one-sided test,TOST)：

(2)

(3)

利用判斷兩個(gè)方差是否相等的F檢驗(yàn)，雙單側(cè)檢驗(yàn)問(wèn)題(2)、(3)的拒絕域分別為

(4)

2．分析相似性檢驗(yàn)

H0:μT-μR≤ΔLorμT-μR≥ΔUvs.

Ha:ΔL<μT-μR<ΔU

(5)

其中(ΔL,ΔU)是分析相似性界值，F(xiàn)DA建議設(shè)置ΔU=-ΔL=c·σR，式中σR表示通過(guò)對(duì)多個(gè)批次參照藥的研究或其他方法得到的該CQA的總體標(biāo)準(zhǔn)差。根據(jù)高個(gè)體差異藥物的生物等效性評(píng)價(jià)方法——標(biāo)化均值生物等效性(scaled average BE,SABE)的等效界值的設(shè)置，系數(shù)c通常設(shè)置為1.5[18]。

分析相似性檢驗(yàn)假設(shè)(5)可以分解為：

H01:μT-μR≤ΔLvs.Ha1:μT-μR>ΔL

(6)

H02:μT-μR≥ΔUvs.Ha2:μT-μR<ΔU

(7)

(8)

利用雙單側(cè)檢驗(yàn)的性質(zhì)[21]，雙單側(cè)檢驗(yàn)問(wèn)題(6)、(7)的拒絕域分別為

(9)

由于生物藥本身的復(fù)雜性，兩種來(lái)源的生物藥在結(jié)構(gòu)或組成方面幾乎不可能完全一致，故候選藥與參照藥的真實(shí)差異μT-μR≠0。根據(jù)拒絕域，我們可以得到雙單側(cè)檢驗(yàn)(6)、(7)的檢驗(yàn)效能函數(shù)為：

χ2(ni-1)(i=T,R)， 則

(10)

模擬與結(jié)果

在前述方法部分，為了評(píng)價(jià)第1層級(jí)CQAs的分析相似性，我們認(rèn)為首先應(yīng)該討論候選藥與參照藥的總體方差是否相似；若兩者總體方差相似，接著根據(jù)推導(dǎo)得出的檢驗(yàn)效能精確公式計(jì)算參數(shù)給定時(shí)的樣本量，進(jìn)而由樣本分析值得出的拒絕域或者置信區(qū)間做出推斷結(jié)論。

按照FDA的建議，令分析相似性界值ΔU=-ΔL=c·σR。為簡(jiǎn)單起見(jiàn)，我們假設(shè)候選藥與參照藥的真實(shí)差異μT-μR也與σR成比例，即μT-μR=θ=f·σR，比例常數(shù)f<

(11)

表1　不同f值(μT-μR=f·σR)、λ值(nR=λ·nT)對(duì)應(yīng)的nT

基于上述討論，兩組樣本量的倍數(shù)關(guān)系nR=λ·nT不太適用，我們假設(shè)兩組樣本量關(guān)系為nR=nT+k，其中k=0,1,2,…,「0.5×nT?，符號(hào)“「?”表示向上取整數(shù)。表2給出了當(dāng)α=0.05，1-β=0.8及分析相似性界值ΔU=-ΔL=1.5×σR時(shí)，不同k值、不同f值對(duì)應(yīng)的樣本量nT，表中帶“()”的數(shù)據(jù)表示不滿足條件nT≤nR≤1.5nT的樣本量nT。如表2第2行k=5列對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)“(7)”表示所得的樣本量為nT=7,nR=12不滿足nT≤nR≤1.5nT。

表2　不同k值(nR=nT+k)、f值(μT-μR=f·σR)對(duì)應(yīng)的nT

綜上，我們可以得出評(píng)價(jià)第1層級(jí)的某CQA的分析相似性的步驟為：

(1)根據(jù)樣本分析值由拒絕域公式(4)判斷候選藥與參照藥在該CQA的方差是否相似。若兩者在該CQA的總體方差相似，則進(jìn)行分析相似性評(píng)價(jià)；

(2)通過(guò)預(yù)試驗(yàn)或?qū)＜翌A(yù)判，確定分析相似性界值ΔU=-ΔL=c×σR及真實(shí)差異μT-μR=f×σR中的c和f，如果實(shí)際獲得的候選藥與參照藥批次關(guān)系為NR>NT，則由類似于表2的結(jié)果確定進(jìn)行分析相似性評(píng)價(jià)的候選藥批次nT和參照藥批次nR；

(3)采用所有參照藥的批次數(shù)據(jù)估計(jì)該CQA的總體標(biāo)準(zhǔn)差σR；

(4)從所有參照藥的批次NR中隨機(jī)抽取樣本數(shù)據(jù)nR，根據(jù)拒絕域公式(9)判斷候選藥與參照藥該CQA是否具有分析相似性；

(5)重復(fù)第(4)步105次，統(tǒng)計(jì)得到兩組該CQA的“分析相似性”結(jié)論的次數(shù)。若頻率大于95%則可作出推斷，候選藥與參照藥在該CQA具有分析相似性。

實(shí)　　例

已知進(jìn)行分析測(cè)定的參照藥與候選藥的實(shí)際批次分別是NR=52,NT=8。某CQA具體的樣本分析值分別為：

XR=(10.9,9.7,10.2,9.4,10.2,10.1,10.0,9.8,9.2,9.1,9.0,9.2,9.8,9.7,8.9,10.2,10.1,9.6,9.3,9.1,9.3,9.8,9.6,8.5,9.0,8.9,9.8,8.7,8.3,9.3,9.2,9.4,8.8,10.5,10.6,9.3,9.4,10.0,8.8,9.2,9.0,10.3,9.0,8.3,8.6,8.6,8.4,8.5,8.7,8.7,8.3,8.3)；XT=(9.8,9.0,9.2,9.0,10.2,8.6,9.4,9.0)。

討　　論

本文通過(guò)推導(dǎo)的檢驗(yàn)效能精確公式，數(shù)值模擬給出了不同參數(shù)k,f(nT=nR+k、μT-μR=f×σR)對(duì)應(yīng)的樣本量方案，得出了評(píng)價(jià)某第1層級(jí)CQAs的分析相似性的具體步驟和方法，可行性強(qiáng)，對(duì)藥企研究人員有很好的實(shí)踐指導(dǎo)意義。也就是說(shuō)，如果對(duì)于不同的生物制品，藥企經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)后得到系數(shù)f、c的估計(jì)值，則可以通過(guò)本文提出的樣本量選取策略，確定候選藥與參照藥的樣本量，根據(jù)本文提出的分析相似性評(píng)價(jià)步驟，作出兩者是否具有分析相似性的推斷結(jié)論。