郭澤鑌 陳竟豪 賈祥澤 盧 旭 鄭寶東

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002;2. 福建省特種淀粉品質(zhì)科學(xué)與加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

蓮(NelumbonuciferaGaertn.)廣泛分布于中國福建、江蘇、湖北、江西等南方各省。有研究[1]表明，小鼠口服蓮子發(fā)酵乳后，其結(jié)腸運(yùn)動加快且腸道糞便停留時(shí)間減少，表明發(fā)酵乳中含有多種與棉子糖類似的糖類物質(zhì)。這是由于蓮子中富含生物活性低聚糖-蓮子低聚糖(Lotus seed oligosaccharides, LOS)，其主要成分為二、三、四糖，各單體結(jié)構(gòu)中糖苷鍵連接方式為Manp-1→Galp-1→α(1→6)-Glcp和α(1→6)-Manp。此外，蓮子低聚糖還可以促進(jìn)青春雙歧桿菌中乙酸、丙酸、丁酸以及消化酶的產(chǎn)生。功能性低聚糖很早就作為腸道功能調(diào)節(jié)劑食用[2]，因而蓮子低聚糖對于促進(jìn)腸道健康具有重要意義[3]。

在食品領(lǐng)域結(jié)合現(xiàn)代高新技術(shù)進(jìn)行生物活性物質(zhì)提取一直為研究熱點(diǎn)，其中微波加熱提取技術(shù)(Microwave-assisted extraction, MAE)已大量應(yīng)用于藥物活性產(chǎn)物萃取研究，在常壓條件下，微波技術(shù)耗能更低并具有較佳的萃取效果。與微波技術(shù)相比超聲提取(Ultrasonic-assisted extraction, UAE)更有效率，能提高傳質(zhì)質(zhì)量和多孔溶劑滲透能力。因此，它可以釋放細(xì)胞內(nèi)不溶性物質(zhì)，減少提取時(shí)間，并在較低溫度下增加產(chǎn)量[4]。此外，超聲輔助萃取不受溶劑、基質(zhì)或水分含量的限制，應(yīng)用性更為廣泛[5]。超聲波—微波協(xié)同提取(Ultrasonic microwave-assisted extraction, UMAE)技術(shù)彌補(bǔ)了前2種技術(shù)存在的不足，目前，UMAE已被應(yīng)用于植物中提取多種活性化合物，如番茄紅素[6]、植物油[7]和多糖[8]等，但未見其應(yīng)用于蓮子低聚糖提取的研究報(bào)道。

本試驗(yàn)擬應(yīng)用超聲波—微波協(xié)同技術(shù)從蓮子中提取低聚糖，通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝參數(shù)，并與其他提取方法進(jìn)行比較,以期保留高得率的同時(shí)降低成本，為蓮子的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮的干蓮：福建綠田食品有限公司；

氯仿、異戊醇、硫酸、95%濃度乙醇、苯酚：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

電動勻漿機(jī)：DY89-1型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

低速臺式離心機(jī)：TDL-5型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

循環(huán)超聲波處理機(jī)：CTXNW-2B型，北京弘祥隆生物技術(shù)股份有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：UV-2550型，日本島津技術(shù)有限公司；

微波萃取儀：MAS-Ⅱ型，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：BUCHI 409型，美國Buchi公司；

冷凍干燥機(jī)：MCFD5505型，美國SIM公司；

鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9030型，北京Tayasaf公司；

植物粉碎機(jī)：FW-80型，天津Taisite公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蓮子低聚糖浸提試驗(yàn) 將速凍鮮蓮解凍1 h后，在50 ℃ 干燥箱中干燥，控制含水量7%左右。將干燥的蓮子用高速粉碎機(jī)粉碎，篩分通過60目(孔徑0.3 mm)備用。將干蓮子粉和去離子水以1∶5 (g/mL)混合。按照Guo等[9]的方法去除蓮子中的淀粉，以排除超聲降解淀粉對低聚糖產(chǎn)量的影響。處理后樣品分別進(jìn)行超聲波和微波處理(超聲波處理功率為300 W)，隨后將濾液進(jìn)行快速真空濃縮，并將5倍濾液體積95%乙醇加入濾液中，在4 ℃下離心20 min后，取上清液冷凍干燥48 h，收集備用[10]。

1.3.2 蓮子低聚糖組分分析 將1.3.2中獲取的粉末與純水混合后使用容量瓶定容至100 mL；取1 mL樣品使用微孔膜過濾(0.22 μm)，自動進(jìn)樣至高效液相色譜(Agilent 1200)定量分析。色譜參數(shù)為：20 μL樣品量，Agilent Hi-plex Na (Octo) 高效液相色譜柱(300 mm×7.7 mm，填料粒徑8 μm)，流動相為屈臣氏蒸餾水，柱溫85 ℃，流速0.6 mL/min。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 綜合前期單因素預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，選取超聲波時(shí)間、超聲溫度、微波功率、微波時(shí)間和液料比5個因素為自變量，因變量為蓮子低聚糖得率，根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理選用N=46的Box-behnken為試驗(yàn)次數(shù)，其中因素水平編碼見表1。

1.3.4 低聚糖得率測定 采用苯酚硫酸法[11]。以葡萄糖溶液濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，葡萄糖吸光度A為縱坐標(biāo)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=0.007 2C-0.003 3，R2=0.998 4。低聚糖得率按式(1)計(jì)算：

表1 Box-behnken試驗(yàn)因素及編碼水平表

Table 1 The levels of variables employed in the present study for the construction of the Box-behnken Design

編碼水平X1超聲時(shí)間/minX2超聲溫度/℃X3微波功率/WX4微波時(shí)間/minX5液料比(mL/g)-1104510060300205520080551306530010080

(1)

式中：

Z——蓮子低聚糖得率，%；

C——換算的葡萄糖溶液濃度，μg/mL；

N——測量時(shí)稀釋倍數(shù)；

m——蓮子干重質(zhì)量，g。

1.3.5 浸取前后蓮子粉末形態(tài)觀察 分別取不同提取方法提取后的蓮子粉末樣品適量，使樣品牢固地附著于樣品臺上，置于真空噴鍍儀,在樣品表面鍍導(dǎo)電層鉑，厚度10 nm，采用掃描電鏡觀察，電子槍加速電壓為5 keV。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析 所有試驗(yàn)均設(shè)置平行樣品并重復(fù)3次，結(jié)果用平均值表示；采用SAS (version 9.1, SAS Institute., Cary, NC, USA)進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 模型構(gòu)建及參數(shù)分析

提取蓮子低聚糖的Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法及結(jié)果見表2。利用SAS軟件對試驗(yàn)測試結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，可得各個單因素對蓮子低聚糖得率的二元多項(xiàng)式回歸模型方程為：

(2)

由表4可知，超聲的時(shí)間(X1)、溫度(X2)與微波時(shí)間(X4)對蓮子中低聚糖得率的影響皆極顯著(P<0.01)，可能與處理的先后順序有關(guān)，超聲波對蓮子植物細(xì)胞的影響強(qiáng)于微波效應(yīng)；微波功率(X3)與液料比(X5)對其得率的影響皆不顯著(P>0.05)，表明微波功率作用可能對最終得率的影響不大。

表2 Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及低聚糖得率實(shí)測值Table 2 Box-behnken Design and actual values of LOS yield

表3回歸模型的方差分析

Table 3 Analysis of variance (ANOVA) testing the fitness of the regression equation

變異來源平方和自由度均方F值P值模型 185.176 8209.258 827.947 2<0.000 1殘差 8.282 4250.331 3失擬項(xiàng)7.533 4200.376 72.514 20.155 5誤差 0.749 150.149 8總和 193.459 345

2.2 響應(yīng)面分析

由圖1(a)與圖2(a)可得，當(dāng)超聲溫度固定時(shí)，低聚糖得率隨超聲時(shí)間的延長表現(xiàn)為先減小再增大的趨勢；當(dāng)超聲時(shí)間水平固定時(shí)，低聚糖得率隨超聲波溫度的增加呈減小的趨勢。由此可得，在超聲波溫度為45～50 ℃，超聲波時(shí)間為10～12 min時(shí)低聚糖得率有極大值。

由圖1(b)與圖2(b)可得，當(dāng)超聲時(shí)間固定時(shí)，低聚糖得率隨微波功率的增大無明顯變化；當(dāng)微波功率水平固定時(shí)，低聚糖得率隨超聲波時(shí)間的延長表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢。由此可得，當(dāng)微波功率為100～150 W，超聲波時(shí)間為10～11 min時(shí)低聚糖得率有極大值。這可能與微波能量對植物材料的離子傳導(dǎo)和偶極旋轉(zhuǎn)效應(yīng)有關(guān)。

由圖1(c)與圖2(c)可得，當(dāng)超聲時(shí)間固定時(shí)，低聚糖得率隨超聲時(shí)間的延長表現(xiàn)為逐漸增加的趨勢；當(dāng)微波時(shí)間水平固定時(shí)，低聚糖得率隨超聲波時(shí)間的延長表現(xiàn)為先增加后下降再增加的趨勢。由此可得，當(dāng)超聲波時(shí)間為10～11 min，微波時(shí)間為95～100 min時(shí)低聚糖得率有極大值。提取時(shí)間是影響產(chǎn)量的重要因素，初始階段溶劑在提取初期吸收微波能量，提高溶劑溫度。這種變化加速了低聚糖在植物細(xì)胞中的溶解，促進(jìn)了其進(jìn)入溶劑。隨著提取時(shí)間的延長，較高的溫度將加速分子運(yùn)動，改變提取溶劑和植物的電導(dǎo)率[14]。另一方面溶劑溫度提高了超聲波的空化效應(yīng)，促進(jìn)了空化細(xì)胞核的形成，導(dǎo)致植物細(xì)胞表面受損，從而促進(jìn)溶劑滲入植物細(xì)胞[15]。這2種效應(yīng)加速了低聚糖在萃取溶劑中的擴(kuò)散，提高得率。

由圖1(d)與圖2(d)可得，當(dāng)超聲時(shí)間固定時(shí)，低聚糖得率隨液料比增大并無明顯變化；當(dāng)液料比水平固定時(shí)，低聚糖得率隨超聲波時(shí)間的延長表現(xiàn)為先增加后降低再上升的趨勢。由此可得，當(dāng)超聲波時(shí)間為10～11 min，液料比為30.00～40.00 (mL/g)時(shí)低聚糖得率有極大值。

表4 回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 4 Testing of the significance of the regression coefficients

由圖1(e)與圖2(e)可得，當(dāng)超聲溫度固定時(shí)，低聚糖得率會隨著微波功率增大表現(xiàn)為先增加后減小的趨勢；當(dāng)微波功率水平固定時(shí)，低聚糖得率隨超聲波溫度的增大表現(xiàn)為逐漸減小的趨勢。由此可得，當(dāng)超聲波溫度為45～47 ℃，微波功率為100～300 W時(shí)低聚糖得率有極大值。

由圖1(f)與圖2(f)可得，當(dāng)超聲溫度固定時(shí)，低聚糖得率隨微波時(shí)間的延長表現(xiàn)為逐漸增加的趨勢；當(dāng)微波時(shí)間水平固定時(shí)，低聚糖得率隨超聲波溫度的增大表現(xiàn)為逐漸減小的趨勢。由此可得，當(dāng)超聲波溫度為45～50 ℃，微波時(shí)間為76～100 min時(shí)低聚糖得率有極大值。

由圖1(g)與圖2(g)可得，當(dāng)超聲溫度固定時(shí)，低聚糖得率隨液料比增大表現(xiàn)為輕微增加隨后減小的趨勢；當(dāng)液料比水平固定時(shí)，低聚糖得率隨超聲波溫度的增大表現(xiàn)為逐漸減小的趨勢。由此可得，當(dāng)超聲波溫度為45～47 ℃，液料比為30.00～80.00 (mL/g)時(shí)低聚糖得率有極大值。

由圖1(h)與圖2(h)可得，當(dāng)微波功率固定時(shí)，低聚糖得率隨微波時(shí)間的延長表現(xiàn)為輕微增加的趨勢；當(dāng)微波時(shí)間水平固定時(shí)，低聚糖得率隨微波功率的增大并無明顯變化。由此可得，當(dāng)微波功率為100～300 W，微波時(shí)間為92～100 min 時(shí)低聚糖得率有極大值。

由圖1(i)與圖2(i)可得，當(dāng)微波功率固定時(shí)，低聚糖得率隨液料比的增大表現(xiàn)為先減小后增加的趨勢；當(dāng)液料比水平固定時(shí)，低聚糖得率隨微波功率的增大表現(xiàn)為輕微的先減小后增加的趨勢。由此可得，當(dāng)微波功率為250～300 W，液料比為為30.00～35.00 (mL/g)時(shí)低聚糖得率有極大值。

由圖1(j)與圖2(j)可得，當(dāng)微波時(shí)間固定時(shí)，低聚糖得率隨液料比的增大表現(xiàn)為逐漸減小的趨勢；當(dāng)液料比水平固定時(shí)，低聚糖得率隨微波時(shí)間的延長表現(xiàn)為逐漸增加的趨勢。由此可得，當(dāng)微波時(shí)間為92～100 min，液料比為75～80 (mL/g) 時(shí)低聚糖得率有極大值。

2.3 參數(shù)優(yōu)化及模型驗(yàn)證

采用響應(yīng)曲面擬合并在單因素最優(yōu)范圍內(nèi)以蓮子低聚糖得率最大為優(yōu)化目的，對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到超聲波微波聯(lián)合提取的最佳條件為：超聲波時(shí)間10.16 min、超聲溫度45 ℃、微波功率100.1 W、微波時(shí)間100 min、液料比30.00∶1 (mL/g)，此條件下預(yù)測低聚糖得率為10.749 3%。為充分考慮實(shí)際試驗(yàn)儀器操作的可行性和所得模型對應(yīng)預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性，將實(shí)際操作參數(shù)修正為：超聲波時(shí)間10 min、超聲溫度45 ℃、微波功率100 W、微波時(shí)間100 min、液料比30.00∶1 (mL/g)，以此條件進(jìn)行實(shí)際參數(shù)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，經(jīng)3次平行實(shí)驗(yàn)后可得蓮子低聚糖得率為(10.525±0.017)%，預(yù)測值與實(shí)際值偏差不大，由此表明響應(yīng)面回歸方程能較好地模擬試驗(yàn)過程和預(yù)測蓮子低聚糖得率，并真實(shí)地反映超聲微波聯(lián)合提取對低聚糖得率的影響。

圖1 交互作用對低聚糖得率影響的響應(yīng)面圖Figure 1 Response surface diagram of the effect of interactions on LSO yield

圖2 交互作用對低聚糖得率影響的等高線圖Figure 2 Contour plots of the effect of interactions on LSO yield

2.4 蓮子低聚糖組分分析

由圖3對照可知，經(jīng)過超聲波-微波協(xié)同提取的蓮子低聚糖由3個組分LSO1、LSO2和LSO3組成，各組分分離度良好，其保留時(shí)間分別為7.019，7.672，8.885 min，而水蘇糖、棉籽糖、蔗糖保留時(shí)間分別為7.054，7.636，8.654 min。LSO1、LSO2和LSO3與水蘇糖、棉籽糖、蔗糖保留時(shí)間幾乎相同，由此可知，LSO1到LSO3分子質(zhì)量依次減小，各組分聚合度為2～4。

1. 水蘇糖 2. 棉籽糖 3. 蔗糖 4. LSO1 5. LSO2 6. LSO3圖3 標(biāo)準(zhǔn)品與蓮子低聚糖高效液相色譜圖

Figure 3 High performance liquid chromatography of standard and lotus seed oligosaccharides

2.5 低聚糖提取方法對比試驗(yàn)

本試驗(yàn)利用超聲波—微波提取低聚糖得到低聚糖實(shí)際得率為(10.525±0.017)%，與熱水浸提低聚糖得率8.09%[16]以及超聲波輔助提取低聚糖實(shí)際得率為(1.13±0.026)%[11]相比，超聲波—微波聯(lián)合提取低聚糖能顯著提高蓮子低聚糖的得率。宋春麗等[17]的研究同樣認(rèn)為超聲波-微波輔助提取低聚糖具有很好的效果，這是由于在處理樣品時(shí)，超聲波首先對蓮子內(nèi)細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)生機(jī)械振動作用，破壞了細(xì)胞壁的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。而微波處理更容易使微波能量穿透細(xì)胞壁從而為蓮子細(xì)胞內(nèi)極性溶液吸收并由內(nèi)部首先產(chǎn)生熱效應(yīng)，導(dǎo)致胞內(nèi)壓力增大，細(xì)胞壁破裂，使低聚糖溶出，2種處理的協(xié)同作用極大地提升了蓮子低聚糖的提取效率[18-19]。綜上所述，超聲波—微波輔助提取法不僅可提高低聚糖得率和提取效率、實(shí)現(xiàn)低溫提取并達(dá)到能耗減少的環(huán)保效果，其對所提取的生物活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能影響較小，產(chǎn)物具有較高的生物活性[20]。

2.6 電鏡分析

在圖4(a)中可以觀測到一些粒徑在10～20 μm的橢球狀顆粒物質(zhì)，為細(xì)胞破壞后殘余的蓮子淀粉顆粒。體系中同時(shí)存在著大量無規(guī)則的膜狀物質(zhì)，很可能是蓮子細(xì)胞在處理過程中破碎，細(xì)胞液流失后殘存下的細(xì)胞壁、膜、器膜等物質(zhì)。說明不同提取方法都對蓮子細(xì)胞產(chǎn)生了破壞作用。

由圖4可以看出，超聲波—微波輔助提取法對蓮子細(xì)胞的破壞程度最大，細(xì)胞壁等膜狀結(jié)構(gòu)破損程度更高，產(chǎn)生了較多細(xì)小的碎片。出現(xiàn)該現(xiàn)象可能是在超聲波—微波聯(lián)合提取法提取時(shí)，細(xì)胞內(nèi)液由于微波作用產(chǎn)生熱效應(yīng)引起細(xì)胞膨脹，導(dǎo)致細(xì)胞漲破后其中的內(nèi)容物被釋放出來。此外超聲波對蓮子細(xì)胞液產(chǎn)生了較強(qiáng)的機(jī)械振動作用，破壞了細(xì)胞壁的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，加速了膜結(jié)構(gòu)的分解[21]。另一方面，水分子可以有效吸收微波能量，有效地加熱樣品[22]。因此通過微波超聲波使蓮子細(xì)胞獲得了劇烈的膨脹和細(xì)胞壁的破裂，允許化合物釋放到溶劑中。這些結(jié)果與以往研究結(jié)果一致[23]，SEM分析提供了微波超聲波作用下高低聚糖提取效率的有力證據(jù)。

圖4 不同方法提取后蓮子粉末的環(huán)境掃描電鏡圖

Figure 4 The micrographs of samples (after different extractions) by environmental scanning electron microscopy

3 結(jié)論

本研究采用響應(yīng)面分析并結(jié)合中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化了蓮子低聚糖超聲波—微波聯(lián)合提取工藝參數(shù)，構(gòu)建超聲時(shí)間與溫度、微波時(shí)間與溫度和液料比對低聚糖得率的二次多項(xiàng)式回歸模型。確定最優(yōu)的提取工藝參數(shù)為：超聲波時(shí)間10 min、超聲溫度45 ℃、微波功率100 W、微波時(shí)間100 min、液料比30∶1 (mL/g)，在該條件下低聚糖得率為10.525%。超聲波—微波協(xié)同提取的蓮子低聚糖由LSO1、LSO2和LSO3組成，LSO1到LSO3分子質(zhì)量依次減小，各組分聚合度為2～4。超聲波—微波聯(lián)合提取相比單獨(dú)熱水和超聲波提取能顯著提高蓮子低聚糖的得率，這與兩者作用加速細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的分解和水分子可以有效吸收微波能量有關(guān)。該技術(shù)可用于蓮子低聚糖的高效提取，可作為功能食品等增值產(chǎn)品的新型原料。后期將從益菌和結(jié)構(gòu)角度對提取的蓮子低聚糖進(jìn)行深入分析。