婁素琳，朱秀蘭，曾志勇，李 輝,4，胡章立,4

1) 深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室，廣東深圳 518060；2) 深圳大學(xué)光電工程學(xué)院，光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點實驗室，廣東深圳 518060；3) 廣東省植物表觀遺傳學(xué)重點實驗室,廣東深圳 518060；4) 深圳大學(xué)龍華生物產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新研究院，深圳市海洋藻類生物工程技術(shù)研究中心，廣東深圳 518060

杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)也稱鹽藻，是一種生長于海水或高鹽環(huán)境的單細(xì)胞光合綠藻，長約14～22 μm，寬約3～14 μm，無細(xì)胞壁，有兩條鞭毛可游動．鹽藻屬于極端生物，可適應(yīng)高鹽、高光、低溫和低pH值等極端環(huán)境，是研究植物耐高鹽分子機制的重要模式生物．鹽藻細(xì)胞營養(yǎng)豐富，含有大量類胡蘿卜素和甘油，β-胡蘿卜素含量最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)干質(zhì)量的14%，商業(yè)價值極高[1]．鹽藻基因組草圖拼接數(shù)據(jù)(Dunaliellasalinagenome sequencing project)已于2017年公布(http://phyto zome.jgi.doe.gov/)[2]，為本研究探索鹽藻非編碼小核糖核酸(micro ribonucleic acid, microRNA 或miRNA)提供了參考．miRNA是一類內(nèi)源性長約21～22個核苷酸堿基(nucleotide, nt)的非編碼小RNA，通過堿基互補配對的方式介導(dǎo)靶mRNA的降解或阻遏靶mRNA的翻譯，從而對基因表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控．miRNA于1993年首次在線蟲體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)[3]，2007年首次在低等單細(xì)胞萊茵衣藻中被發(fā)現(xiàn)[4-5]．這讓人們意識到miRNA很可能是一種古老的調(diào)控機制，且比多細(xì)胞的出現(xiàn)更早．2011年，胡章立等[6]分離鑒定到一些硫脅迫相關(guān)miRNAs．近年來，在低等生物團(tuán)藻、三角褐指藻和微擬球藻中相繼發(fā)現(xiàn)有miRNA存在[7]．本研究利用Illumina HiSeqTM2500高通量測序方法對鹽藻進(jìn)行miRNA測序，探究單細(xì)胞微藻是否普遍存在miRNA．

1 材料與方法

1.1 藻株和培養(yǎng)條件

鹽藻藻株購自英國(https://www.ccap.ac.uk/)．鹽藻培養(yǎng)基為RAMARAJ，培養(yǎng)條件為25 ℃，光照強度為50 μmol·m-2·s-1．鹽藻置于恒溫光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集藻細(xì)胞用于總 RNA提取．

1.2 小RNA的分離和cDNA文庫的構(gòu)建

用TRIzol提取鹽藻總 RNA，瓊脂糖凝膠電泳切膠選擇18～30 nt的片段作為小RNA測序．分別連接3′和5′接頭，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴增．回收并純化約140 bp的條帶，完成文庫構(gòu)建．使用2100 TOF LC-MS質(zhì)譜儀(Agilent，美國)及定量PCR(real-time PCR, RT-PCR)進(jìn)行質(zhì)控，并上機測序．

1.3 鹽藻miRNA的鑒定和靶基因預(yù)測分析

下機數(shù)據(jù)經(jīng)初步過濾，得到用于后續(xù)分析的小RNA clean tags序列．比對GenBank、Rfam數(shù)據(jù)庫及鹽藻參考基因組數(shù)據(jù)，篩選后的clean tags同miRBase中已知的植物或動物miRNA進(jìn)行比對，鑒定得到已知miRNA．結(jié)合鹽藻基因組序列，進(jìn)行發(fā)卡結(jié)構(gòu)預(yù)測，鑒定得到新的miRNA．

使用RNAhybrid(v2.1.2)+svm_light(v 6.01)、Miranda(v3.3a)和TargetScan(version: 7.0)3種方法進(jìn)行靶基因預(yù)測，然后取3種方法得到的靶基因預(yù)測的結(jié)果的交集作為miRNA靶基因預(yù)測的結(jié)果．

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽藻miRNA的測序信息分析

對鹽藻小RNA原始下機數(shù)據(jù)，通過過濾中低質(zhì)量、不帶3′接頭、含有5′接頭、不含插入片段和插入片段長度小于18 nt，以及含有polyA的reads，得到鹽藻小RNA clean tags序列11 542 169條，數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，用于后續(xù)分析. 比對GnenBank數(shù)據(jù)庫、Rfam數(shù)據(jù)庫及杜氏鹽藻的參考基因組(包括內(nèi)含子、外顯子和重復(fù)序列)，3個生物學(xué)重復(fù)的鹽藻clean tags注釋統(tǒng)計分析如表1(取3者平均值)，沒有比對上任何注釋信息的tags為unann．

比對miRBase數(shù)據(jù)庫和篩選后的clean tags數(shù)據(jù)，3個生物學(xué)重復(fù)獲得鹽藻已知miRNA 分別為42、41和44個．比對鹽藻參考基因組及其miRNA前體發(fā)卡結(jié)構(gòu)預(yù)測，3個重復(fù)分別獲得鹽藻新的miRNA 920、880和957個.

表1 鹽藻小RNA測序的tags豐度統(tǒng)計

2.2 鹽藻miRNA靶基因富集分析

對鹽藻所有miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測分析，并對靶基因進(jìn)行GO功能分析和KEGG Pathway分析．對靶基因進(jìn)行功能注釋和歸類，功能富集分析發(fā)現(xiàn)，靶基因主要集中在細(xì)胞代謝進(jìn)程(約450個靶基因)、分子功能的結(jié)合(約500個靶基因)和催化活性(約500個靶基因)等生物途徑，說明鹽藻miRNA活躍參與調(diào)節(jié)這幾個途徑的基因表達(dá)．

3 討論

本研究在杜氏鹽藻中發(fā)現(xiàn)miRNA的存在，不僅豐富了人們對微藻miRNA的認(rèn)識，也為揭示miRNA這一古老調(diào)控機制廣泛存在于低等單細(xì)胞微藻提供了依據(jù)，為后續(xù)研究miRNA是如何調(diào)控鹽藻積累β-胡蘿卜素的分子機制研究奠定了基礎(chǔ).關(guān)于鹽藻miRNA靶基因的預(yù)測，本研究結(jié)合了動植物兩套模式來預(yù)測，因為最新的研究表明微藻和動物類似，miRNA的種子序列與靶基因配對就足以導(dǎo)致靶基因表達(dá)抑制[8]．后續(xù)的研究將對靶基因進(jìn)行RT-PCR和RACE(rapid-amplification of cDNA ends)實驗驗證．