趙方　陳鵬　焦劍　胡明道　黃明　劉鋒　許曄凱

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽胰外科一病區(qū), 云南 昆明650101)

肝移植術(shù)后的排斥反應(yīng)是目前肝移植領(lǐng)域面臨的一大難題和挑戰(zhàn)。在臨床上, 術(shù)前及術(shù)后對于免疫抑制劑的使用多種多樣, 但長期用藥的經(jīng)濟負擔(dān)和全身免疫抑制帶來的副作用仍給患者帶來極大困擾。誘導(dǎo)免疫耐受被認為是解決肝移植排斥反應(yīng)的理想方案[1-2]。通過基因工程誘導(dǎo)特異性免疫耐受來控制移植后的免疫排斥反應(yīng)可能是一種可行的方法[3]。TLR4信號傳導(dǎo)途徑在介導(dǎo)免疫排斥反應(yīng)中起重要作用[4], 而MyD88作為TLR4信號通路的接頭蛋白分子, 在通路信息傳遞中有關(guān)鍵性作用[5-6]。通過構(gòu)建恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒載體來抑制MyD88分子的表達, 進而抑制TLR4 / MyD88 / NF-κB通路活化, 則可能降低移植免疫排斥反應(yīng)。本研究構(gòu)建恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒載體, 為誘導(dǎo)恒河猴肝移植免疫耐受的后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實驗材料腸桿菌TOP10菌種及293細胞株由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院昆明生物學(xué)研究所提供, PCR用試劑primer(R&F)由上海吉凱基因公司合成, T4噬菌體DNA連接酶、10XT4噬菌體DNA連接酶緩沖液購自New England Biolabs(NEB)公司, 質(zhì)粒抽提試劑盒購自Qiagen公司, Invitrogen Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司, Adeno-XTM純化試劑盒購自Microbix 公司, BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自HyClone-Pierce 公司, 10×buffer、5×Taq buffer、dNTPs(2.5mM)、Taq polymerase購自Takara公司；羊抗鼠IgG購自Abcan公司；蛋白Marker(10～170kDa)購自Thermo公司。Western細胞裂解液、SDS-PAGE電泳液、Western轉(zhuǎn)膜液、SDS凝膠配置試劑盒、WesternⅠ抗稀釋液、WesternⅡ抗稀釋液、PMSF、Western封閉液、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(2×)、millipore顯影試劑盒購自碧云天公司。

1.2實驗方法

1.2.1恒河猴MyD88RNAi穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 登陸美國國立生物信息中心(NCBI)查詢恒河猴MyD88的堿基序列和mRNA序列: GeneBank序列號為NM-001130681, mRNA: 891bp。針對目的基因序列, 恒河猴MyD88siRNA設(shè)計并合成為: GTACAAGGCAATGAAGAAA, 進一步合成恒河猴MyD88RNAi基因片段(雙鏈DNA Oligo)如下：上游: 5′-CCGGAAGTACAAGGCAATGAAGAAACT CGAGTTTCTTCATTGCCTTGTACTTTTTTTG-3′, 下游: 5′TTCATGTTCCGTTACTTCTT TCTCGAGAAAGAAGTAACGGAACATGAAAAAAAC TTAA-3′。然后通過T4噬菌體DNA連接酶將GV119載體酶切后與MyD88siRNA鏈接后轉(zhuǎn)化CaCl2大腸桿菌TOP10菌種感受態(tài)細胞。對長出的陽性克隆進行PCR鑒定(陽性克隆PCR片段大小為 343bp；空載體克隆PCR片段大小為306 bp)；將陽性轉(zhuǎn)化子保存為甘油菌, 各分裝200μl進行測序?qū)Ρ取?/p>

1.2.2重組腺病毒載體的包裝通過coli菌株DH5α擴增腺病毒穿梭質(zhì)粒和輔助包裝載體質(zhì)粒。培養(yǎng)HEK293細胞, 以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度在35%左右, 重新接種于T25瓶, 恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24h左右待細胞密度達到50%～60%時即可用于轉(zhuǎn)染。然后混勻穿梭質(zhì)粒5μg和輔助質(zhì)粒5μg與DMEM于離心管中, 調(diào)整體積為50μl。將Lipofectamine 2000試劑輕柔搖勻, 取10μl Lipofectamine 2000試劑在另一管中與50μl DMEM混合, 在室溫下溫育 5 min后, 與稀釋后的 DNA進行混合, 以便形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。 將上述混合液轉(zhuǎn)移至 HEK293 細胞的培養(yǎng)液中, 混勻, 置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。約10～15d后, 待大部分HEK293細胞出現(xiàn)細胞病變(cytopathic effect, CPE), 且有50%的細胞脫壁, 收集細胞重懸于2 ml DMEM中, -70℃/37℃反復(fù)凍融、震蕩3次, 于4℃ 7000g離心5 min, 收集病毒上清于-70℃保存。

1.2.3恒河猴MyD88腺病毒的擴增和純化擴增上述所得粗提液獲得更多的腺病毒載體, 首先, 稀釋HEK293細胞4倍后傳入另一個T25細胞培養(yǎng)瓶中, 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞匯合程度達到60%以上, 吸棄舊培養(yǎng)液, 加入復(fù)制缺陷型腺病毒重組成功后收獲的粗提液2 ml并孵育90 min, 最后, 補加3 ml DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。大部分細胞出現(xiàn)典型的CPE, 收集細胞并重懸于2ml DMEM中, -70℃/37℃反復(fù)冶融、振蕩 3 次, 于4℃ 7000 g離心5 min, 收集病毒上清于-70℃保存。重復(fù)上述步驟, 完成第二輪擴增。將以上兩輪所得的病毒上清液按BD Adeno-X的步驟進行純化并分裝, -70℃保存。

1.2.4重組腺病毒的滴度檢測按上述步驟純化重組腺病毒后感染HEK293細胞, 通過終點稀釋方法來算出病毒滴度。病毒滴度計算方法為: 病毒滴度=10(X+0.8)(PFU/mL), X=10-1～10-11依次稀釋細胞病變陽性率總和。

1.2.5MyD88蛋白表達的檢測前期實驗已將恒河猴骨髓血進行分離提純得到CD34+細胞[7]。將CD34+細胞種入12孔板中, 添加含10%FBS的1640完全培養(yǎng)基, 并加入細胞因子GM-CSF、IL-4(其濃度分別為100ng/ml、50ng/ml), 置于37℃、5%CO2的溫箱內(nèi)培養(yǎng)；將培養(yǎng)至第7d的樹突狀細胞進行腺病毒的感染, 經(jīng)腺病毒感染效率檢測, 當MOI為500～600時所構(gòu)建的腺病毒對恒河猴樹突狀細胞可獲得最佳感染效率。感染恒河猴樹突狀細胞48h后收集樹突狀細胞總蛋白進行Western blot檢測。

2　結(jié)果

2.1GV119載體的酶切及鑒定GV119載體質(zhì)粒經(jīng)單酶切消化后呈現(xiàn)均一的電泳條帶, 此時可與Marker對比判斷其分子量大小, 載體酶切產(chǎn)物大小約為 5.5kb, 與預(yù)期大小相符合, 見圖1A。

2.2MyD88目的基因真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞結(jié)果對照本實驗受體細胞為E.coli DH5α菌株, 用 CaCl2 處理受體菌使其處于為感受態(tài), 然后與質(zhì)粒共保溫, 實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。恒河猴MyD88目的基因真核質(zhì)粒并帶有氨芐青霉素抗性基因, 對于含氨芐青霉素抗生素性質(zhì)的LB瓊脂培養(yǎng)基為陽性反應(yīng), 轉(zhuǎn)化組A中的菌落可以存活并分散生長, 說明轉(zhuǎn)化成功。因為沒有氨芐青霉素抗性基因, 所以菌落無生長，見表1。雖然對照組C沒有氨芐青霉素抗性基因, 但其是處于不含氨芐青霉素抗生素性質(zhì)的LB瓊脂培養(yǎng)基上, 故可生長良好。對照組的結(jié)果可以證實在實驗過程中排除了除基因以外的其他干擾因素。

表1恒河猴MyD88目的基因真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞結(jié)果對照

Table1MucacamulattamyD88geneofeukaryoticplasmidtransformedEscherichiacolicompetentcells

　項目轉(zhuǎn)化組A對照組B對照組CLB瓊脂培養(yǎng)基抗性++-菌落抗性+--菌落轉(zhuǎn)化結(jié)果分散生長無生長成片生長

2.3恒河猴MyD88目的基因與GV119載體連接轉(zhuǎn)化子本實驗以少許菌液作為模板進行PCR擴增, 圖1B中1為陰性對照, 我們采用最常用的ddH2O, 正常情況下圖1B中1 應(yīng)無任何條帶, 若有條帶則為假陽性, 可能為試劑被模板污染等。圖1B中2為空載體自連對照組, 因載體帶的目的基因siRNA較短， 且引物設(shè)計在載體上, 所以空載體也有片段。圖1B中3為Marker, 自5kb至100bp。圖1B中4～8為帶有目的基因的質(zhì)粒載體。電泳分析檢測, 可見陽性克隆PCR片段大小約343bp, 空載體克隆PCR片段大小為306bp, 與理論條帶大小一致, 見圖1B。

2.4恒河猴MyD88RNAi真核質(zhì)粒陽性克隆測序圖及結(jié)果分析挑取重組陽性克隆, 接種于含氨芐青霉素LB培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng), 抽提質(zhì)粒后測序, 測序結(jié)果顯示前期實驗所得恒河猴MyD88-RNAi序列與本實驗?zāi)康幕驕y序所得序列一致, 無突變或移碼, 進一步確定了PCR擴增產(chǎn)物為我們所要得到的目的基因, 表明成功構(gòu)建重組干擾質(zhì)粒。該測序結(jié)果圖由綠、紅、藍和黑色測序峰組成, 代表不同的堿基序列。該圖中峰型正常, 未見異常雜帶, 見圖1C。

2.5腺病毒滴度觀察情況 將重組穿梭質(zhì)粒MyD88siRNA和骨架質(zhì)粒在HEK293細胞中共轉(zhuǎn)染, 48 h后在熒光顯微鏡下見HEK293細胞中有綠色熒光蛋白表達, 直到病毒稀釋至10-11時與空白對照對比不明顯, 可計算樣品腺病毒滴度大致為2.0E+10pfu/ml, 見圖2。

2.6MyD88siRNA對MyD88蛋白表達作用在image quent成像系統(tǒng)下進行曝光, 可見33kD處出現(xiàn)特異性條帶, 在43kD處可見β-actin內(nèi)參成功表達, 干擾組MyD88蛋白的表達明顯降低, 可推斷MyD88siRNA對樹突狀細胞中的MyD88蛋白表達具有抑制作用, 見圖1D。

圖1　恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒載體的鑒定Figure1　Identification of adenovirus vector of mucaca mulatta myD88 gene silencing

注: A.GV119載體, Age I/ EcoR I酶切電泳圖; B.恒河猴MyD88-RNAi轉(zhuǎn)化子電泳圖； C.恒河猴MyD88-RNAi測序圖； D.western blot鑒定MyD88在imDC中的表達

圖2　腺病毒滴度觀察Figure 2　Adenovirus titer observation

注: a、b、c、d、e、f分別是稀釋病毒原液至10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11時熒光顯微鏡下觀察的情況(×100), g是空白對照

3　討論

目前國內(nèi)外嚙齒類動物尤其小鼠關(guān)于腺病毒載體構(gòu)建及誘導(dǎo)免疫耐受的報道較多, 相關(guān)結(jié)果卻多缺乏臨床應(yīng)用價值, 究其原因在于嚙齒類動物在基因相似度上和人吻合度高, 但免疫系統(tǒng)和人類卻有較大差異, 因此采用和人類高度相似非人靈長類實驗動物恒河猴進行免疫相關(guān)研究有重要意義。目前恒河猴免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)染病毒載體構(gòu)建報道少見, 本研究構(gòu)建恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒載體, 為下一步用于誘導(dǎo)恒河猴肝移植免疫耐受奠定基礎(chǔ), 具有重要的應(yīng)用價值。

腺病毒載體是目前基因工程中廣泛使用的病毒載體之一, 腺病毒載體的轉(zhuǎn)基因效率較高, 體外實驗的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率通常接近100%；而且可以對不同類型的人組織細胞進行轉(zhuǎn)導(dǎo), 不會受到靶細胞是否為分裂細胞所限制；能夠比較容易得到高滴度病毒載體, 在細胞培養(yǎng)物中重組病毒滴度可達(10E+11)/ml；其進入細胞后并不整合到宿主細胞基因組, 快速表達, 安全性較高[8-9]。在基因治療臨床試驗方面腺病毒載體已經(jīng)得到了越來越多的應(yīng)用, 成為繼逆轉(zhuǎn)錄病毒載體之后最具前景的病毒載體[10-11]。而且腺病毒載體也被廣泛用于RNAi中[12], 這也是本實驗采用腺病毒作為載體的原因之一。

MyD88是TLR信號通路的重要信號成員, 在該通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用[13-14]?；诖擞^點, 在本實驗中我們將MyD88作為研究靶點, 應(yīng)用RNA干擾技術(shù)特異性抑制MyD88的表達以期達到在末端MyD88水平阻斷TLR信號通路的目的。

通過前期試驗工作篩選得到有效恒河猴MyD88RNAi真核質(zhì)粒載體, 而后進行設(shè)計合成。在恒河猴MyD88siRNA腺病毒載體的制備過程中, 菌落PCR電泳分析檢測, 可見擴增產(chǎn)物出現(xiàn)特異性條帶, 陽性克隆PCR片段大小與理論值相符合。隨后的陽性克隆測序中, 測序結(jié)果顯示前期實驗所得恒河猴MyD88-RNAi序列與本實驗?zāi)康幕驕y序所得序列一致, 無突變或移碼, 進一步確定了PCR擴增產(chǎn)物為我們預(yù)期目的基因一致, 表明成功構(gòu)建重組干擾質(zhì)粒。最后將恒河猴DC經(jīng)MyD88siRNA腺病毒載體感染48h后, 進行WB檢測, 結(jié)果顯示干擾組蛋白表達降低, 由此可推斷MyD88siRNA對恒河猴樹突狀細胞中的MyD88蛋白表達具有抑制作用。實驗后續(xù)采用MyD88siRNA腺病毒載體感染恒河猴imDC, 從而體外實驗觀察其對恒河猴imDC生物學(xué)特性的影響, 為臨床肝移植提供了一個新的治療途徑。

4　結(jié)論

本實驗結(jié)果顯示, 成功構(gòu)建恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒載體,MyD88siRNA對恒河猴樹突狀細胞中的MyD88蛋白表達具有抑制作用, 為研究肝移植免疫耐受提供了基礎(chǔ)路徑。 此實驗使用的是與人類基因排列高度相似的非人靈長類實驗動物恒河猴, 較其他實驗動物有較大的優(yōu)越性。恒河猴生理上與人類接近, 是較理想的肝移植免疫耐受模型的實驗動物[15-18], 目前國內(nèi)外有關(guān)牛、綿羊、禽類尤其是小鼠關(guān)于腺病毒載體構(gòu)建及誘導(dǎo)免疫耐受的報道較多, 但是恒河猴MyD88 siRNA腺病毒載體構(gòu)建并用于誘導(dǎo)恒河猴肝移植免疫耐受的研究報道相當少見[19-21], 因此, 構(gòu)建恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒載體為誘導(dǎo)恒河猴肝移植免疫耐受奠定了重要基礎(chǔ)。