張凡慶　陳玉雪　楊　亮　龔建培　朱建國(guó)*

（1上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院/上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240；2上海富朗特動(dòng)物保健股份有限公司，上海 201502；3浙江海正動(dòng)物保健品有限公司，浙江臺(tái)州 318099）

隨著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，豬場(chǎng)的規(guī)模逐漸變大，豬群數(shù)量變多，同時(shí)一些疾病非常容易在豬場(chǎng)傳播，特別是豬腹瀉病。目前豬腹瀉病的發(fā)病原因分為兩類：傳染性疾病引起的腹瀉和非傳染性因素造成的腹瀉。傳染性腹瀉是由病毒、細(xì)菌引起，病毒包括流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒等；細(xì)菌包括大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等。非傳染性腹瀉因素包括仔豬消化功能不全、日糧抗原過(guò)敏、食入腐敗飼料、應(yīng)激因素等。非傳染性腹瀉危害小且治愈快，而傳染性疾病危害較大，特別是病毒性疾病，通常迅速感染整個(gè)豬場(chǎng)，造成仔豬大量腹瀉和死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

病毒性腹瀉最常見(jiàn)的病原有兩種：流行性腹瀉病毒（PEDV）和傳染性胃腸炎病毒（TGEV）[1,2]。PEDV和TGEV都能夠引起豬的嘔吐、水樣腹瀉和脫水癥狀，各年齡段都能發(fā)病，2周齡以內(nèi)的仔豬發(fā)病率和死亡率最高，甚至達(dá)到100%。TGEV和PEDV均屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，病毒粒子呈圓形或橢圓形，外有囊膜，直徑80～100 nm，為RNA病毒。病毒結(jié)構(gòu)蛋白包括纖突蛋白（S）、小膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣殼蛋白（N），這些病毒蛋白介導(dǎo)了病毒的感染、入侵和釋放等多個(gè)過(guò)程[3]。眾所周知，這兩種病毒感染所致的仔豬腹瀉表現(xiàn)為發(fā)病急、機(jī)體脫水嚴(yán)重、營(yíng)養(yǎng)狀況惡化，經(jīng)常未來(lái)得及治療發(fā)病仔豬就已衰竭死亡。這一現(xiàn)象在本課題組前期利用單鏈抗體進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)治療時(shí)也曾出現(xiàn)。

在生產(chǎn)實(shí)踐中，許多一線技術(shù)人員通常將奶粉與溫開(kāi)水沖泡后代替母乳飼喂仔豬，補(bǔ)充仔豬所需的各種營(yíng)養(yǎng)，提高仔豬免疫力和快速促進(jìn)仔豬的生長(zhǎng)。此外，當(dāng)仔豬發(fā)生如腹瀉病等疾病時(shí)，飼喂乳制品也能夠加速病畜的康復(fù)，提高存活率。受此啟發(fā)，本研究將課題組前期制備、經(jīng)仔豬保護(hù)試驗(yàn)證實(shí)具有良好保護(hù)效果的抗PEDV和TGEV的scFv與奶粉聯(lián)合應(yīng)用，分析該方法在發(fā)病豬場(chǎng)的臨床治療價(jià)值。

1　材料

His-Trap純化樹(shù)脂購(gòu)自英國(guó)GE公司；PBS緩沖液購(gòu)自Thermo公司；5×SDS-PAGE電泳緩沖液購(gòu)自碧云天生物科技有限公司。

2　方法

2.1　scFv的純化

從-20℃取出凍存的攜帶scFv基因的菌株（分別與pET-28a(+)載體連接），接種至2YT-K平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。第2天挑取單菌落接種至2YT液體培養(yǎng)基中，待OD600nm達(dá)到0.6時(shí)加入10 mM IPTG，過(guò)夜誘導(dǎo)。將誘導(dǎo)后的菌液超聲破碎后取上清，使用AKTA purifier純化系統(tǒng)進(jìn)行純化。

取純化后的少量樣品加入5×SDS-PAGE電泳緩沖液，煮沸10分鐘后進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，分析純化后蛋白的純度。

2.2　仔豬腹瀉治療試驗(yàn)

試驗(yàn)在一個(gè)正在流行仔豬腹瀉病的豬場(chǎng)進(jìn)行。該豬場(chǎng)先前的ELISA和PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)豬群感染了PEDV和TGEV，仔豬感染后連續(xù)腹瀉和嘔吐，4～5天出現(xiàn)大量死亡。剖檢發(fā)現(xiàn)胃內(nèi)有大量?jī)?nèi)容物，胃壁和小腸出血，伴有腸壁臌脹和變薄，腸系膜淋巴結(jié)出血；糞便呈水樣黃色。

仔豬的分組和處理情況見(jiàn)表1。一共分為3個(gè)處理組，第1個(gè)處理組包括母豬欄號(hào)A和B，對(duì)仔豬灌胃抗體和奶粉；第2個(gè)處理組包括母豬欄號(hào)C和D，對(duì)仔豬灌胃抗體，不使用奶粉；第3個(gè)處理組包括母豬欄號(hào)E和F，對(duì)仔豬只灌服奶粉，不灌服抗體?？贵w每次灌胃量為3 mL，濃度為0.5 mg/mL，灌胃時(shí)間為0小時(shí)、24小時(shí)和72小時(shí)；人工喂奶時(shí)間分別為10小時(shí)、14小時(shí)和36小時(shí)。抗體處理后24小時(shí)開(kāi)始記錄仔豬的拉稀和存活情況。

3　結(jié)果

3.1　抗PEDV和TGEV scFv的純化

將原核表達(dá)的菌液使用超聲破碎儀進(jìn)行裂解，裂解后的產(chǎn)物離心后取上清用AKTApurifier系統(tǒng)進(jìn)行純化。紫外分光光度計(jì)測(cè)定PEDV scFv和TGEV scFv的OD260nm/OD280nm值分別為0.882和0.865，說(shuō)明蛋白純度較高。根據(jù)蛋白濃度=（1.55×OD280nm）-（0.76×OD260nm）公式計(jì)算得出PEDV scFv和TGEV scFv的濃度分別為1.622 mg/mL和1.681 mg/mL。

表1　試驗(yàn)仔豬分組情況

將純化后的scFv進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果證實(shí)純化的蛋白在28 kDa處出現(xiàn)單一的條帶，且純度較高（見(jiàn)圖 1）。

圖1　scFv的SDS-PAGE電泳

3.2　仔豬腹瀉治療實(shí)驗(yàn)

scFv+奶粉處理組（A、B）的平均存活率為72.7%，scFv處理組（C、D）的平均存活率為65%，只加奶粉組（E、F）的平均存活率僅為8.3%。t檢驗(yàn)計(jì)算得出scFv+奶粉處理組、scFv組的治療效果明顯優(yōu)于只加奶粉組（＜0.01） （見(jiàn)圖2）。scFv+奶粉處理組比scFv處理組存活率提高了7.7%，雖然t檢驗(yàn)差異不顯著，但也能看出添加奶粉對(duì)提高機(jī)體免疫力有一定效果。

4　討論

4.1　scFv純化方法

原核表達(dá)的蛋白產(chǎn)物通常使用His標(biāo)簽，便于純化。本研究中的scFv基因序列與pET-28（+）載體連接，也攜帶His標(biāo)簽。普通實(shí)驗(yàn)室純化使用重力純化蛋白，雖然操作方便，但是純化量不高。為了滿足臨床大量應(yīng)用的需要，本研究使用了AKTA蛋白快速純化系統(tǒng)純化蛋白，該系統(tǒng)使用惰性氣體管道，環(huán)境溫和，可以減少對(duì)蛋白質(zhì)活性的影響；能夠快速大量純化重組蛋白，進(jìn)行中試生產(chǎn)；具有3個(gè)分析器（紫外/可見(jiàn)光檢測(cè)器、電導(dǎo)檢測(cè)器、pH檢測(cè)器），能夠直接對(duì)純化樣品分析[6]。

表2　仔豬存活情況

圖2　仔豬腹瀉治療的存活率

4.2　scFv治療效果

目前對(duì)PEDV和TGEV的防治以疫苗免疫為主。TGEV的變異程度較PEDV低，因此比較容易防控。PEDV在2010年時(shí)出現(xiàn)了變異株，傳統(tǒng)的疫苗不能對(duì)變異株起到保護(hù)作用，造成了該病在豬場(chǎng)的大規(guī)模流行，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。本研究中使用的scFv針對(duì)目前變異的PEDV，先前的細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明該scFv具有中和及保護(hù)作用。

本研究證實(shí)scFv對(duì)PEDV和TGEV的共同感染具有很好的治療效果。scFv單獨(dú)處理后仔豬的存活率達(dá)到65.0%，而不使用scFv的仔豬存活率只有8.3%，證明scFv具有很好的治療作用。同時(shí)scFv+奶粉共同處理組使仔豬的存活率進(jìn)一步提高到72.7%，提示抗體和奶粉具有共同使用的臨床價(jià)值。值得注意的是，本次實(shí)驗(yàn)中scFv與奶粉為分開(kāi)飼喂，而先前的研究表明當(dāng)抗體與乳汁共同飼喂時(shí)，乳汁中的成分還能夠減少抗體被胃酸的破壞，提高抗體的有效治療量[7]。將抗體與奶粉同時(shí)投喂仔豬是否具有更好的治療效果有待于進(jìn)一步研究。