李曉靜 韓宗元,2 王曉彤 陸辰燕 王仙紛 吳秀月 肖志剛

(沈陽工學(xué)院生命工程學(xué)院1，撫順 113122) (沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院2，沈陽 110866) (沈陽師范大學(xué)糧食學(xué)院3，沈陽 110034)

紅樹莓籽是紅樹莓果實加工過程的副產(chǎn)物，約占紅樹莓鮮重的10%，因紅樹莓籽的萌發(fā)率很低，一般不作播種，常被丟棄[1]，但紅樹莓籽油含有豐富的亞油酸、α-亞油酸、油酸和棕櫚酸等，具有顯著的抗衰老、防曬等功能,是具有良好加工前景的油脂。研究紅樹莓籽油一方面可以了解籽油的成分及保健作用；另一方面可以提高紅樹莓果綜合利用價值[2]。紅樹莓籽油提取方法有壓榨法[3]、浸出法[4]、索氏提取法[5]、超聲波輔助提取法[6]、微波輔助提取法[7]、超臨界流體萃取法[8]和酶法提取等[9]。

水酶法是一種新興的植物油脂提取技術(shù)，是利用酶制劑破壞、降解植物種子的細(xì)胞壁，使油脂游離出來的一種新型提取技術(shù)，因其工藝條件溫和，適用于油料作物，受到廣泛關(guān)注。水酶法提取大豆、花生、葵花籽、油菜籽等油脂已有深入研究[10]，劉曠[11]分別采用7種商業(yè)蛋白酶進(jìn)行酶解，以油脂得率為評價指標(biāo)，篩選出Alcalase 2.4 L水解酶用于提取大扁杏仁油。王麗波等[12]為了提高南瓜籽油的出油率和油脂品質(zhì)，采用水酶法提取南瓜籽油，結(jié)果表明：酸性蛋白酶:纖維素酶:果膠酶的復(fù)合酶配比為1:6:6時，南瓜籽油出油率最高為38.34%，且所提取的南瓜籽油色澤明亮，澄清透明，富含不飽和脂肪酸、植物甾醇和維生素E等營養(yǎng)成分，理化性質(zhì)也優(yōu)于超臨界二氧化碳法和超聲波溶劑萃取法。張佰清等[13-14]研究微波和超聲波輔助提取紅樹莓籽油的生產(chǎn)工藝，并得出最佳工藝條件，且提油率分別為17.57%、12.97%。扶慶權(quán)[15]以正己烷為有機(jī)溶劑，采用正交實驗優(yōu)化微波輔助提取紅樹莓籽油的最佳工藝，其紅樹莓籽油得率為16.52%；辛秀蘭等[2]采用超聲波輔助溶劑浸提法提取紅樹莓籽油，出油率為13.50%。但是水酶法提取紅樹莓籽油的研究，在國內(nèi)外還很少，且紅樹莓籽油作為植物精油，營養(yǎng)價值高，而水酶法具有工藝設(shè)備簡單，處理條件溫和，操作安全等特點，可以最大限度的保持紅樹莓籽油的營養(yǎng)成分。本實驗以紅樹莓籽為原料，采用不同復(fù)合酶法提取紅樹莓籽油，并利用Box-Behnken法優(yōu)化其工藝參數(shù)，為開發(fā)紅樹莓籽油提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅樹莓籽(產(chǎn)地沈陽)；胃蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶：沈陽瑞豐精細(xì)化學(xué)品有限公司；石油醚、乙醚：沈陽市華森試劑公司；鹽酸、氫氧化鈉等：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LD210-2R型電子天平：沈陽龍騰電子有限公司；HWS-28電熱恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；pH計：杭州美控自動技術(shù)有限公司；GFL-70型鼓風(fēng)干燥箱：天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；臺式離心機(jī)：金壇市國旺實驗有限公司；索氏提取器：建湖縣明啟玻璃儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

將鮮紅樹莓去除果肉，清洗后，收集紅樹莓籽，將紅樹莓籽放置于鼓風(fēng)干燥箱中，于105 ℃殺青滅酶處理15 min，然后在65 ℃條件下恒溫烘干至水分含量在14%左右，最后將干燥后的紅樹莓籽放入高速萬能粉碎機(jī)中粉碎，過60目篩，收集紅樹莓籽粉密封，備用。

1.3.2 實驗方法

準(zhǔn)確稱取處理后一定量的紅樹莓籽粉至于燒杯中，加入5倍水，混勻后進(jìn)行酶解實驗，酸性復(fù)合酶水解：酶添加順序，酸性纖維素酶(pH=5，50 ℃)、果膠酶(pH=3.5，50 ℃)、胃蛋白酶(pH=2，37 ℃)酶解時間分別為70 min，50 min,60 min，酶解總時間3 h；堿性復(fù)合酶水解：酶添加順序，α-淀粉酶(pH=7.0，60 ℃)、胰蛋白酶(pH=8.0，37 ℃)、堿性蛋白酶(pH=10，45 ℃)酶解時間分別為60 min，60 min,60 min，酶解總時間3 h。反應(yīng)完成后100 ℃滅酶10 min，4 500 r/min離心30 min，收集上清液及殘渣，將殘渣于105 ℃處理15 min，然后在65 ℃條件下恒溫烘干至恒重，對烘干至恒重的的殘渣進(jìn)行稱量，用索氏提取法測定殘渣中的含油量及計算提油率。

1.3.3 單因素實驗

分別以胃蛋白酶添加量0.25%～2.0%、果膠酶0.5%～3.0%、酸性纖維素酶0.5%～3.0%、α-淀粉酶0.5%～3.0%、胰蛋白酶0.5%～3.0%和堿性蛋白酶0.5%～3.0%為單因素，考察各因素對紅樹莓籽油提取率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面分析實驗設(shè)計

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，采用Box-Behnken設(shè)計方法，酸性復(fù)合酶組合：以胃蛋白酶、酸性纖維素酶、果膠酶添加量為自變量，以紅樹莓籽油提取率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken法設(shè)計原理，設(shè)計響應(yīng)面分析實驗見表1。

堿性復(fù)合酶組合：以α-淀粉酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶添加量為自變量，以紅樹莓籽油提取率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken法設(shè)計原理，設(shè)計響應(yīng)面分析實驗見表2。

表1 酸性復(fù)合酶因素水平編碼表

表2 堿性復(fù)合酶因素水平編碼表

1.3.5 提油率計算

原料含油率及殘渣中油脂含量測定采用GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》。

提油率(%)=(A×B-C×D)/(A×B)×100%[16]

式中：A為原料紅樹莓籽質(zhì)量/g；B為原料紅樹莓籽含油率；C為酶解后殘渣質(zhì)量/g；D為酶解后殘渣含油率。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均進(jìn)行3次平行實驗。數(shù)據(jù)采用Desigh expert 8.06進(jìn)行分析。不同處理間的數(shù)據(jù)采用多重比較方法，顯著水平為0.05，采用標(biāo)記字母法進(jìn)行標(biāo)記。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 酸性復(fù)合酶添加量對提油率的影響

由圖1可知，在0.25%～0.50%范圍內(nèi)，隨著胃蛋白酶添加量的增加，紅樹莓籽的出油率逐漸增大，當(dāng)胃蛋白酶的添加量在0.50%時，紅樹莓籽的提油率最高，當(dāng)胃蛋白酶添加量在0.50%兩端時，紅樹莓籽的出油率呈現(xiàn)下降的趨勢。胃蛋白酶可與樹莓籽外壁的蛋白結(jié)合，破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，有助于油脂提取，但其外壁還有果膠、纖維素等多糖，從而影響胃蛋白酶提油的效果[17-18]。圖1可知，在0.50%～2.00%范圍內(nèi)，隨著果膠酶添加量的增加，紅樹莓籽的提油率逐漸增大，當(dāng)果膠酶添加量為2.00%時，紅樹莓籽的提油率達(dá)到最大，當(dāng)果膠酶添加量在2.00%兩側(cè)時，紅樹莓籽提油率出現(xiàn)下降趨勢。其原因在于果膠酶可以與細(xì)胞壁中果膠結(jié)合，破壞其結(jié)構(gòu)，提高出油率，但細(xì)胞壁中蛋白質(zhì)和纖維素、半纖維素等成分會影響其提油效果[17]。隨著酸性纖維素酶添加量的增加，紅樹莓籽的出油率先變大后保持穩(wěn)定，當(dāng)纖維素酶的添加量在1.00%時，紅樹莓籽的出油率最大，見圖1。這是因為細(xì)胞壁中主要成分為纖維素和半纖維素，酸性纖維素酶可以很好將其酶解，使細(xì)胞壁成分發(fā)生降解，因此酸性纖維素酶對提油率的影響基本保持穩(wěn)定，變化幅度較小[17]。但三種酸性酶單一作用都有一定的局限性，對其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞程度不完全，因此需要將三種酶進(jìn)行復(fù)合使用。

圖1 酸性復(fù)合酶添加量對提油率影響

2.1.2 堿性復(fù)合酶添加量對紅樹莓籽提油率的影響

由圖2可知，隨著α-淀粉酶的添加量的增加，紅樹莓籽的提油率緩慢變大，當(dāng)α-淀粉酶的的添加量在2.50%時，紅樹莓籽的提油率最大。當(dāng)α-淀粉酶的添加量在2.50%兩側(cè)時，紅樹莓籽的提油率均降低。因為油脂除了有細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)保護(hù)外，還與多糖結(jié)合形成脂多糖，所以α-淀粉酶可以將多糖水解，使油脂游離出來，提高出油率。圖2可知，在0.50%～2.00%范圍內(nèi)，隨著胰蛋白酶添加量的增加，紅樹莓籽的出油率不斷的增加，當(dāng)胰蛋白酶添加量在2.00%時，紅樹莓籽的出油率最高。因為胰蛋白酶可與蛋白質(zhì)結(jié)合破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，有助于油脂釋放。在0.50%～2.00%范圍內(nèi)，隨著堿性蛋白酶添加量的增加，紅樹莓籽的提油率也隨著增加，當(dāng)堿性蛋白酶添加量在2.00%時，紅樹莓籽的提油率最高，見圖2。因為油脂易與蛋白質(zhì)結(jié)合形成脂蛋白，堿性蛋白酶可與蛋白質(zhì)結(jié)合，有助于油脂分離，聚集[17-18]。單一堿性酶也存在酸性酶的問題，因此堿性酶也需要復(fù)合提高樹莓籽出油率。

圖2 堿性復(fù)合酶添加量對提油率影響

2.2 響應(yīng)面實驗分析

2.2.1 酸性復(fù)合酶提取紅樹莓籽油的響應(yīng)面實驗與分析

以胃蛋白酶添加量A，果膠酶添加量B，酸性纖維素酶添加量C為自變量，紅樹莓籽油提油率Y1為響應(yīng)值，優(yōu)化實驗設(shè)計和響應(yīng)值如表3所示，分別進(jìn)行12組析因?qū)嶒灒?組中心實驗，通過實驗優(yōu)化降低實驗誤差。

通過Design expert 8.06得到以下方程：

提油率Y1=86.02-0.2A-0.18B+0.18C-0.053AB+0.22AC+0.3BC-2.75A2-0.031B2-C2

表3 響應(yīng)面實驗結(jié)果分析(酸性復(fù)合酶)

按照顯著性檢驗，一次項：A、B、C；二次項：AC、BC、A2、C2，上述提到的因素項影響顯著(P<0.05)。表3反映通過F檢驗得到因素貢獻(xiàn)率為：A>C>B(胃蛋白酶添加量>果膠酶添加量>酸性纖維素酶添加量)。

表4 回歸與方差分析結(jié)果

2.2.2 堿性復(fù)合酶提取紅樹莓籽油的響應(yīng)面實驗與分析

以α-淀粉酶添加量A，胰蛋白酶添加量B，堿性蛋白酶添加量C為自變量，紅樹莓籽油提油率Y2為響應(yīng)值，優(yōu)化實驗設(shè)計和響應(yīng)值如表5所示，分別進(jìn)行12組析因?qū)嶒灒?組中心實驗，通過實驗優(yōu)化降低實驗誤差。

通過Design expert 8.06得到以下方程：

提油率Y2=88.62+0.14A-0.18B+0.19C+0.28AB-0.14AC+0.3BC-2.84A2-0.041B2-1.04C2

表5 響應(yīng)面實驗結(jié)果分析(堿性復(fù)合酶)

按照顯著性檢驗，一次項：A、B、C；二次項：AB、AC、BC、A2、C2，上述提到的因素項影響顯著(P<0.05)。表6反映通過F檢驗得到因素貢獻(xiàn)率為：C>B>A(堿性蛋白酶添加量>胰蛋白酶添加量>α-淀粉酶添加量)。

表6 回歸與方差分析結(jié)果

2.2.3 最佳復(fù)合酶提取紅樹莓籽油條件的確定及驗證實驗

酸性復(fù)合酶水解紅樹莓籽提取紅樹莓籽油的響應(yīng)面分析法得到的最佳條件為：胃蛋白酶添加量0.76%，果膠酶添加量1.51%，酸性纖維素酶添加量1.07%，提油率(86.11±0.09)%；堿性復(fù)合酶水解紅樹莓籽提取紅樹莓籽油的響應(yīng)面分析法得到的最佳條件為：胰蛋白酶添加量1.52%，堿性蛋白酶添加量1.99%，α-淀粉酶添加量2.52%，提油率為(88.75±0.08)%。

在最佳條件下進(jìn)行3次平行實驗，胃蛋白酶添加量0.76%，果膠酶添加量1.51%，酸性纖維素酶添加量1.07%，3次平行實驗提油率分別為85.98%，86.21%，86.10%，平均值為86.10%；胰蛋白酶添加量1.52%，堿性蛋白酶添加量1.99%，α-淀粉酶添加量2.52%，3次平行實驗提油率分別為88.63%，88.85%，88.71%，平均值為88.73%。這說明相應(yīng)值符合回歸預(yù)測值，并且模型能預(yù)測紅樹莓籽油提油率的實際條件。

3 結(jié)論

通過Box-Behnken實驗設(shè)計及響應(yīng)面分析，對水酶法提取紅樹莓籽油的工藝進(jìn)行優(yōu)化，酸性復(fù)合酶水解紅樹莓籽提取紅樹莓籽油的響應(yīng)面分析法得到的最佳條件為：胃蛋白酶添加量0.76%，果膠酶添加量1.51%，酸性纖維素酶添加量1.07%，提油率可達(dá)86.10%；堿性復(fù)合酶水解紅樹莓籽提取紅樹莓籽油的響應(yīng)面分析法得到的最佳條件為：胰蛋白酶添加量1.52%，堿性蛋白酶添加量1.99%，α-淀粉酶添加量2.52%，提油率可達(dá)88.73%。

對比兩種復(fù)合酶水解提取法，堿性復(fù)合酶水解法提取紅樹莓籽油的提取率略高于酸性復(fù)合酶水解法，但兩種復(fù)合酶酶解提取法均大于單酶提取法，通過F檢驗得到因素貢獻(xiàn)率為：堿性復(fù)合酶的因素貢獻(xiàn)率依次為：堿性蛋白酶添加量>胰蛋白酶添加量>α-淀粉酶添加量)；酸性復(fù)合酶的因素貢獻(xiàn)率依次為：胃蛋白酶添加量>果膠酶添加量>酸性纖維素酶添加量。