王慧超，張威，李鐵軍

(河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南　開封　475000)

高尿酸血癥(HUA)是一種常見的慢性非傳染性代謝性疾病，早期臨床上常無明顯伴隨癥狀及體征，其危害性也往往被人們所忽視。高尿酸血癥是一種尿酸鹽超飽和狀態(tài)，當(dāng)超過其最大溶解度時可以析出結(jié)晶沉積關(guān)節(jié)處誘發(fā)炎癥進而引起痛風(fēng)，因而HUA也通常被認作是痛風(fēng)發(fā)生的最直接原因和生化基礎(chǔ)[1]。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，餐桌膳食搭配比例的改變以及人口老齡化趨勢，高尿酸血癥患病率在國內(nèi)外均呈現(xiàn)出上升趨勢,成為嚴(yán)重危害大眾健康的主要疾患之一，我國成人高尿酸血癥的的患病率為8.4%～13.3%，對其防治刻不容緩[2-4]。

目前，HUA的治療可采用藥物和非藥物治療相結(jié)合的手段。臨床上常用降血尿酸的西藥主要為抑制尿酸生成和促進尿酸排泄兩類[5]。前者以別嘌醇片，后者以苯溴馬隆片、丙磺舒為代表。臨床降尿酸作用顯著，但與此同時，在服藥過程中的副作用也會不同程度的出現(xiàn)，如皮疹、消化道刺激、血液系統(tǒng)損害、肝腎功能損害等，嚴(yán)重時危及生命，影響患者的持續(xù)服藥，病情出現(xiàn)反復(fù)，一定程度上限制了其在臨床上的應(yīng)用[6-7]。尋找新型安全有效的降尿酸藥物也因此成為了國內(nèi)外醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。中醫(yī)藥治療從整體觀出發(fā)，辨證論治，標(biāo)本兼顧，同時注重個體差異，近年來通過采用健脾補腎、清熱利濕、活血化瘀等治則，在治療高尿酸血癥上取得了較好的療效，且副作用少，獲得了更多的關(guān)注[8]。但對于作用機理研究還相對不夠深入，因此通過中藥干預(yù)實驗性高尿酸血癥,加強中醫(yī)藥治療HUA的作用機制研究,對本病的治療具有重要意義。

痛風(fēng)泄?jié)岱绞菍?dǎo)師根據(jù)長期臨床經(jīng)驗總結(jié)，結(jié)合眾多醫(yī)家的思想，在二妙散基礎(chǔ)上加味而成，臨床應(yīng)用中取得了較好的療效，具有明顯止痛，降低血尿酸作用。近年隨著流行病學(xué)的深入研究，發(fā)現(xiàn)HUA與代謝綜合征、心血管疾病、腎臟疾病等密切相關(guān)，因此，HVA發(fā)生與否也和系統(tǒng)性免疫炎性反應(yīng)存在一定的關(guān)系，炎癥因子在其中有怎樣的表現(xiàn)，都是這一領(lǐng)域亟待解決的問題。目前我們對高尿酸血癥炎癥反應(yīng)過程中參與的炎癥因子及其機制仍未完全明確。本文擬通過觀察痛風(fēng)泄?jié)岱綄Ω吣蛩嵫Y大鼠的IL-17/IL-23水平，進一步驗證其降尿酸療效，并初步探討其作用機制，為HUA的防治提供了一定的參考，也為本方今后臨床推廣應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　實驗動物

SD雄性SPF級健康大鼠60只,體質(zhì)量(200±20)g,購自河南省實驗動物中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開始實驗。隨機分為對照組、模型組、痛風(fēng)泄?jié)岱礁邉┝拷M、痛風(fēng)泄?jié)岱街袆┝拷M、痛風(fēng)泄?jié)岱降蛣┝拷M、別嘌醇組，每組10只。

1.2　主要試劑與藥物

1.2.1試劑

黃嘌呤氧化酶(XO)試劑盒(A002，南京建成生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(20201ES76，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；IL-17(ab119535)、IL-23 ELISA(ab64708)試劑盒，IL-17一抗(Abcam，ab79056)，IL-23一抗(Abcam，ab45420)，免疫組化二抗試劑盒(SP0023，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；DAB顯色試劑盒(AR1022，武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2.2藥物

陽性對照組藥物采用別嘌醇片(100 mg/片，上海信誼萬象藥業(yè)股份有限公司，100片/盒，國藥準(zhǔn)字：H31020344)；造模藥物應(yīng)用鹽酸乙胺丁醇片(0.25 g/片，上海信誼藥廠有限公司，100片/盒，國藥準(zhǔn)字：H31021140)、腺嘌呤(AdenineAladdin industrial Corportion)；治療藥物藥物為痛風(fēng)泄?jié)岱剑翰捎弥兴幟饧孱w粒(深圳市三九現(xiàn)代中藥有限公司)，購于淮河醫(yī)院草藥房。組方：黃柏15 g，蒼術(shù)15 g，防已20 g，苦參15 g，土茯苓30 g，澤瀉15 g，萆薢15 g，豬苓15 g，紅花15 g，桃仁15 g，川芎15 g，全蝎10 g，穿山甲10 g，青風(fēng)藤30 g，伸筋草30 g，共計生藥265 g。

1.3　主要儀器及耗材

酶標(biāo)儀(ELX800，BioTek)；微量臺式高速離心機(TG15-W，湖南湘儀實驗室儀器有限公司)；多功能全自動生化分析儀(7180，日立)；生化培養(yǎng)箱(上海一恒科儀有限公司)；輪轉(zhuǎn)切片機(KD-1508A，科迪儀器)；快速勻漿器(SK96-A，江蘇新康醫(yī)療器械有限公司)；普通光學(xué)顯微鏡及拍照系統(tǒng)(上海光學(xué)儀器廠)；黏附載玻片(25 mm×75 mm，江蘇世泰實驗器材有限公司)；精密電子分析天平(梅特勒)；85-2恒溫磁力攪拌器(江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠)。

2　方法

2.1　高尿酸血癥模型復(fù)制

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，參照文獻，取0.05 g/ml鹽酸乙胺丁醇和0.02 g/ml腺嘌呤進行灌胃造模。上午9點給予腺嘌呤(100 mg/kg)+乙胺丁醇(250 mg/kg)進行灌胃,1次/日；當(dāng)日下午2點給予蒸餾水灌胃，共14 d。

2.2　給藥方法

以成人體質(zhì)量60 kg計算，按人鼠藥物劑量換算1 kg大鼠劑量約為1公斤成人體重的6.3倍計算給藥量，不同劑量之間呈2倍遞增關(guān)系，設(shè)痛風(fēng)泄?jié)岱礁摺⒅?、低生藥劑量組(24 g/kg、12 g/kg、6 g/kg)，分別配制成1.6 g/ml、0.8 g/ml、0.4 g/ml濃度藥液，按15 ml/kg灌胃，置于4℃冰箱備用；別嘌醇片給藥劑量為10 mg/kg，研末配制成0.68 mg/ml，按15 ml/kg灌胃，置于4℃冰箱備用。治療組處理如下：上午9點給予腺嘌呤(100 mg/kg)+乙胺丁醇(250 mg/kg)進行灌胃,1次/日；當(dāng)日下午2點給予1.6 g/ml痛風(fēng)泄?jié)岱交?.68 mg/ml別嘌醇灌胃，給藥體積按15 ml/kg，共14 d。

2.3　指標(biāo)觀察方法

2.3.1一般情況觀察

每日密切觀察大鼠飲食、飲水、運動及尿量情況。

2.3.2血清XO檢測

設(shè)置空白管與測定管并標(biāo)記，每組取10份大鼠血清標(biāo)本，再次離心取上清液，分裝標(biāo)記置于冰盒上，提前取出試劑1、試劑4，前者置于水浴鍋融化(37℃水浴)，后者臨用前稀釋，冰上操作；準(zhǔn)備完畢后，空白管滴加60 μl蒸餾水，測定管滴加60 μl上清液，避光條件下兩管均依次滴加試劑1、2、3、4后混勻，37℃水浴20 min，隨后滴加試劑5，混勻，反應(yīng)液體積共2.33 ml，取200 μl加入微量樣板孔，采用酶標(biāo)儀進行測定OD值。

2.3.3IL-17、IL-23檢測

取大鼠血清，參照ELISA試劑盒操作說明，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測血清中IL-17、IL-23水平。

2.3.4腎組織病理學(xué)觀察

各組大鼠采血后，迅速置于操作臺，取腎組織，置于4%多聚甲醛中固定，8h后依次進行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(5 μm)，進行蘇木素-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡觀察染色情況并進行攝片分析。

2.3.5肝組織XO水平測定

取肝組織置于-80℃冰箱備用，實驗前解凍標(biāo)本，每組選取10個標(biāo)本，均稱取0.35 g，分管標(biāo)記，按照1:9的比例(即重量：體積)加入0.9%生理鹽水3.15 ml，置于冰上，機械勻漿，勻漿液(10%)配制完汲取同體積用BCA法測定勻漿液蛋白濃度，余下勻漿液在3 000 r/min轉(zhuǎn)速條件下離心10 min，留取上清備測OD值，步驟同血清XO測定。

2.3.6腎臟組織中IL-17、IL-23表達檢測

組織切片脫蠟至水化，微波修復(fù)抗原，3% H2O2消除非特異性染色，正常山羊血清封閉，一抗過夜，二抗孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。各實驗組隨機取5個標(biāo)本，各個標(biāo)本隨機拍照3個高倍視野，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0分析系統(tǒng)進行半定量分析。

2.4　統(tǒng)計學(xué)方法

3　結(jié)果

3.1　一般狀態(tài)觀察

由于預(yù)實驗熟練掌握了灌胃技術(shù)，在模型復(fù)制和灌胃過程中，未發(fā)生灌胃導(dǎo)致的死亡。與正常組比較，模型大鼠飲食、飲水量減少，活動緩慢，毛色欠光澤，尿量明顯減少，各治療組與對照組一般情況無統(tǒng)計學(xué)意義。

3.2　血清XO水平比較

如表1所示，與對照組比較，模型組大鼠XO水平明顯升高(P<0.01)，經(jīng)痛風(fēng)泄?jié)岱礁?中劑量預(yù)治療，XO水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，但低劑量組與陽性對照組無明顯差異(P>0.05)。

表1　血清黃嘌呤氧化酶(XO)水平比較

注：與A組比較，**P<0.01;與B組比較，#P<0.05,##P<0.01

3.3　血清IL-17、IL-23水平比較

如表2所示，經(jīng)灌胃造模后，大鼠血清IL-17、IL-23水平明顯升高，從對照組(0.05±0.02)pg/ml，(0.03±0.01)pg/ml，升高至(41.64±11.23)pg/ml，(29.88±7.99)pg/ml，(P<0.05)， 痛風(fēng)泄?jié)岱礁邉┝拷MIL-17、IL-23水平較模型組明顯降低(23.65±6.85)pg/ml，(17.88±4.63)pg/ml，(P<0.05或P<0.01)，痛風(fēng)泄?jié)岱街袆┝拷MIL-17、IL-23水平也明顯降低(32.94±8.86)pg/ml，(9.67±5.97)pg/ml，(P<0.05或P<0.01)，低劑量組與陽性對照組比較無明顯差異(P>0.05)。

表2　血清IL-17、IL-23水平比較

注：與A組比較，**P<0.01；與B組比較，#P<0.05,##P<0.01

圖1　腎組織病理學(xué)改變(HE染色，400×)

3.4　腎組織病理學(xué)改變

如圖1所示。對照組：腎組織結(jié)構(gòu)正常，正常形態(tài)腎小球，結(jié)構(gòu)清楚、無硬化萎縮，腎間質(zhì)未見炎性細胞浸潤，間質(zhì)區(qū)及管腔內(nèi)未見尿酸鹽結(jié)晶沉積，腎近曲及遠曲小管上皮細胞未見腫脹，脫落，空泡變性表現(xiàn)，管腔無擴大。模型組：大量腎小球出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象，硬化，腎間質(zhì)可有大量炎性細胞浸潤表現(xiàn)，間質(zhì)區(qū)及管腔內(nèi)有較多尿酸鹽結(jié)晶沉積，大量腎小管上皮細胞出現(xiàn)水腫，脫落，空泡變性，管腔擴張明顯。痛風(fēng)泄?jié)岱礁邉┝拷M：少量腎小球有萎縮現(xiàn)象，但無硬化，腎間質(zhì)可有少量散在炎性細胞浸潤表現(xiàn)，間質(zhì)區(qū)及管腔內(nèi)偶見尿酸鹽結(jié)晶沉積，小部分腎小管上皮細胞出現(xiàn)水腫，脫落，空泡變性，管腔無明顯擴張。痛風(fēng)泄?jié)岱街袆┝拷M：部分腎小球有萎縮現(xiàn)象，但無硬化，腎間質(zhì)可有少量散在炎性細胞浸潤表現(xiàn)，間質(zhì)區(qū)及管腔內(nèi)可見少量尿酸鹽結(jié)晶沉積，部分腎小管上皮細胞出現(xiàn)水腫，脫落，空泡變性，部分管腔明顯擴張。痛風(fēng)泄?jié)岱降蛣┝拷M：部分腎小球出現(xiàn)萎縮、硬化，腎間質(zhì)大量炎性細胞浸潤，間質(zhì)區(qū)及管腔內(nèi)可見較多尿酸鹽結(jié)晶沉積，大量腎小管上皮細胞表現(xiàn)出水腫、脫落及空泡變性等特點，管腔擴大明顯。別嘌醇組：部分腎小球出現(xiàn)萎縮、硬化，腎間質(zhì)少量炎性細胞浸潤，間質(zhì)區(qū)及管腔內(nèi)可見少量尿酸鹽結(jié)晶沉積，部分腎小管上皮細胞表現(xiàn)出水腫、脫落及空泡變性等特點，部分管腔明顯擴張。

3.5　肝組織XO水平

由表3與對照組比較，模型組大鼠肝組織XO水平明顯升高(P<0.01)，經(jīng)痛風(fēng)泄?jié)岱礁?中劑量預(yù)治療，XO水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，而低劑量組與模型組比較無明顯差異(P>0.05)。

表3　肝臟組織黃嘌呤氧化酶(XO)水平比較

注：與A組比較，**P<0.01；與B組比較，##P<0.01

3.6　腎臟組織中IL-17、IL-23表達

如圖2所示，免疫組化結(jié)果顯示：對照組大鼠腎組織內(nèi)可見到IL-17、IL-23表達微弱；病變組織內(nèi)IL-17、IL-23蛋白表達面積增加，顏色深，半定量分析統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，平均光密度較對照組明顯升高(P<0.05)，與模型組比較，痛風(fēng)泄?jié)岱礁摺⒅袆┝拷M大鼠腎組織內(nèi)IL-17、IL-23平均光密度明顯降低(P<0.05)，中劑量組和別嘌醇組較模型組平均光密度有下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果見表4。

圖2　腎臟組織中IL-17、IL-3表達情況比較

組別nIL-17IL-23對照組(A)100.397±0.0670.185±0.049模型組(B)100.693±0.094**0.498±0.091**痛風(fēng)泄?jié)岱礁邉┝拷M(C)100.467±0.066#0.301±0.010#痛風(fēng)泄?jié)岱街袆┝拷M(D)100.508±0.087#0.395±0.072#痛風(fēng)泄?jié)岱降蛣┝拷M(E)100.602±0.0960.446±0.083別嘌醇組(F)100.612±0.1080.417±0.089

注：與A組比較，**P<0.01；與B組比較，##P<0.01

4　討論

高尿酸血癥(HUA)是一種常見的非傳染性代謝性疾病，隨著物質(zhì)生活改善、膳食搭配比例改變以及人口老齡化，高尿酸血癥患病率在國內(nèi)外均呈上升趨勢。鑒于高尿酸血癥的高患病率及與其他疾病并發(fā)，世界衛(wèi)生組織將高尿酸血癥列入代謝綜合征范疇，已成為繼糖尿病之后的第二大代謝類疾病，對其防治刻不容緩[2]。

HUA的發(fā)生有基因缺陷、尿酸合成增多或(和)排泄障礙等。前期的研究發(fā)現(xiàn),HUA常伴發(fā)高血壓、脂代謝紊亂、糖代謝異常、肥胖等，因此慢性低毒炎癥反應(yīng)貫穿始終；痛風(fēng)是尿酸鹽微結(jié)晶觸發(fā)體內(nèi)炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致的急性發(fā)作，由此我們是否也可以推測在未發(fā)展至痛風(fēng)的長期高尿酸血癥的患者其體內(nèi)也存在慢性低度炎癥，從而引發(fā)血管內(nèi)皮損傷[9]。炎性細胞因子具有多種生物學(xué)效應(yīng)，是一類主要由免疫系統(tǒng)細胞生成的內(nèi)源性多肽，亦可介導(dǎo)多種免疫反應(yīng)。近幾年，人們對代謝性疾病的發(fā)病機制的研究不斷深入，多項研究指出：低度的慢性的系統(tǒng)性炎性反應(yīng)也是代謝性疾病發(fā)生的核心之一，同時也是代謝綜合征各個組分間的聯(lián)系點和紐帶。因此，本文從炎癥因子的角度探討高尿酸血癥的發(fā)生機制及痛風(fēng)泄?jié)岱降闹委煓C制。

IL-17是首次在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的新型促炎性細胞因子[10]，2007年發(fā)現(xiàn)IL-17是由一類從CD4+T細胞分化而來的名為Th17的細胞分泌的[11-12]，目前研究已證實，IL-17與多種自身免疫病發(fā)病機制有關(guān)，被認為具有介導(dǎo)炎性反應(yīng)、自身免疫性疾病等重要免疫調(diào)節(jié)作用[13-15]。IL-23是IL-12分子家族中的促炎性細胞因子，參與機體控制 感染和自身免疫性疾病發(fā)生[16]。IL-23對于維持Thl7細胞增殖和存活有重要的意義和作用，IL-23還可以顯著增強IL-17的分泌和產(chǎn)生[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，HUA血清及組織中IL-17及IL-23水平和表達均明顯升高，提示細胞因子是HUA病理過程中重要的發(fā)病機制，而痛風(fēng)泄?jié)岱皆诮档脱蛩崴剑纳颇I損傷能的同時，有效抑制血清及組織IL-17及IL-23水平和蛋白表達，表明痛風(fēng)泄?jié)岱娇赡芡ㄟ^抑制炎性細胞因子起到降低血尿酸的治療作用。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為,HUA患病原因總體歸于尿酸生成增多或(和)排泄障礙兩方面因素[18-19]。尿酸生成方面，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為體內(nèi)參與嘌呤代謝相關(guān)酶的活性異常是導(dǎo)致尿酸合成增多的重要因素，其中XO作為嘌呤代謝終末階段的關(guān)鍵酶，直接調(diào)控尿酸的合成，影響顯著并且也已成為開發(fā)降尿酸新藥的重要靶點[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠血清及組織中XO水平明顯增高，高、中劑量的痛風(fēng)泄?jié)岱侥苡行Ц纳七@種高XO狀態(tài)，提示痛風(fēng)泄?jié)岱娇赡芡ㄟ^抑制XO活性起到降低血尿酸的治療作用。但XO與IL-23/IL-17在HUA發(fā)病過程中的因果關(guān)系，目前尚未見任何報道，這些研究內(nèi)容將是我們課題組今后重點研究的重點。

綜上，痛風(fēng)泄?jié)岱娇捎行Ы档蛯嶒灤笫笱蛩崴?，改善腎功能，改善實驗大鼠腎臟病理損害，保護修復(fù)腎單位，減輕腎組織炎癥反應(yīng)。痛風(fēng)泄?jié)岱浇档脱蛩崴降臋C制可能與抑制實驗大鼠血清及肝XO活性，下調(diào)腎小管IL-17/IL-23蛋白表達有關(guān)。