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        二色補(bǔ)血草總黃酮對功能性子宮出血模型大鼠子宮內(nèi)膜VEGF、MMP-9表達(dá)的影響

        2018-07-12 07:03:16歐莉苗彥霞呂娟衛(wèi)培峰
        中醫(yī)藥信息 2018年4期
        關(guān)鍵詞:空白對照黃酮內(nèi)膜

        歐莉,苗彥霞,呂娟,衛(wèi)培峰

        (陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西 咸陽 712046)

        無排卵型功能失調(diào)性子宮出血(Anovulatory Dysfunctional Uterine Bleeding,ADUB)又被稱為無排卵型功血,是一種發(fā)病率較高的婦科內(nèi)分泌疾病,臨床表現(xiàn)為月經(jīng)周期紊亂,經(jīng)期時(shí)長時(shí)短,出血量過多或表現(xiàn)為不規(guī)則出血,屬中醫(yī)學(xué)“崩漏”的范疇[1-2]。二色補(bǔ)血草來源于白花丹科補(bǔ)血草屬的多年生草本植物,全草入藥;主要分布于遼寧、河北、甘肅、陜西、江蘇、內(nèi)蒙古等地。味甘、微苦,性微溫,入脾、肝、膀胱經(jīng),有化瘀止血、益血通脈的功效,主治月經(jīng)失調(diào)、崩漏下血、鼻衄、外傷出血等[3]。ADUB的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚,研究發(fā)現(xiàn)可能是由于神經(jīng)內(nèi)分泌功能失調(diào),子宮內(nèi)膜局部微環(huán)境出現(xiàn)改變,子宮內(nèi)膜修復(fù)不能正常完成,導(dǎo)致子宮異常性出血[4]。子宮微環(huán)境中存在大量的生長因子、血管活性物質(zhì)、蛋白酶及細(xì)胞外基質(zhì),均參與了功血的發(fā)生發(fā)展過程。本實(shí)驗(yàn)組前期的研究發(fā)現(xiàn),二色補(bǔ)血草中主要成分總黃酮能通過雌激素樣物質(zhì)與孕激素樣物質(zhì)的共同協(xié)同作用治療ADUB[5-6],但其如何作用于子宮內(nèi)膜局部微環(huán)境以及與血管新生的相關(guān)性目前尚不清楚。本文通過大鼠去勢造模并利用雌激素負(fù)荷法建立ADUB子宮內(nèi)膜增生癥大鼠模型,并觀察給予二色補(bǔ)血草總黃酮,大鼠子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達(dá)水平的變化,以期進(jìn)一步解釋其治療ADUB的作用機(jī)制。

        1 材料

        1.1 儀器設(shè)備

        恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9075A型,上海一恒科技有限公司);高速臺(tái)式離心機(jī)(TGL-16G型,上海安亭科學(xué)儀器廠);電泳儀(型號WS300,河北萬生博朗電子有限公司);全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)(型號ZF-288,上海嘉鵬科技有限公司);彩色病理圖像分析儀(型號M305487,西化儀——科技有限公司);熒光定量PCR儀(型號7300,美國(北京)應(yīng)用生物系統(tǒng)ABI公司)。

        1.2 藥物

        參照文獻(xiàn)[7]提取二色補(bǔ)血草總黃酮。料液比1∶10,濃度60%的乙醇為提取劑,回流提取3次,每次40 min。提取總黃酮后濃縮至38.8 mg/ml,4℃保存?zhèn)溆谩m血寧膠囊(0.13 g×18粒/盒,云南白藥集團(tuán)股份有限公司,批號20160724);苯甲酸雌二醇注射液(天津金耀氨基酸有限公司,1 mg/ml,批號1606171)。

        1.3 試劑

        兔抗大鼠VEGF、TIMP-1抗體、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒和SABC試劑盒(武漢博士德生物制品有限公司);RNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司);大鼠VEGF引物、大鼠TIMP-1引物(南京金斯瑞生物科技有限公司);Trans DNA Marker Ⅰ、PCR supermixⅠ、Ⅱ(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。

        1.4 動(dòng)物

        SPF級雌性SD大鼠,體質(zhì)量180~220 g,購自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號:SCXK(陜)2012-003。

        2 方法

        2.1 動(dòng)物分組及造模

        選取60只健康雌性SD大鼠,每組10只,隨機(jī)分為6組:空白對照組、模型對照組、二色補(bǔ)血草總黃酮低、中、高劑量組和宮血寧組。除空白對照組外,其余大鼠手術(shù)取出雙側(cè)卵巢,術(shù)后第3天肌注苯甲酸雌二醇注射液(無菌花生油稀釋至0.15 mg/ml),隔日1次,連續(xù)給藥14 d。空白對照組進(jìn)行開關(guān)腹手術(shù),術(shù)后第3天肌注相同體積無菌花生油[8]。

        二色補(bǔ)血草總黃酮低、中、高劑量組分別灌胃給予二色補(bǔ)血草總黃酮97 mg/kg,194 mg/kg,388 mg/kg;宮血寧組灌胃給予宮血寧膠囊水溶液70 mg/kg;空白對照組和模型對照組灌胃給予相同體積的蒸餾水。去勢造模后第7 d開始灌胃給藥,1次/天,連續(xù)給藥14 d。第14天給藥后處死大鼠,將大鼠子宮表面的脂肪組織去掉后冰浴中分為兩部分,液氮速凍后-70℃冰箱保存。

        2.2 S-P免疫組化法檢測各組大鼠子宮內(nèi)膜VEGF、MMP-9的表達(dá)

        將子宮內(nèi)膜組織置10 %多聚甲醛中固定,石蠟包埋,5 μm切片;采用免疫組化S-P法對切片進(jìn)行染色。切片常規(guī)脫蠟水化后,滴加稀釋倍數(shù)為1:250的一抗,4℃孵育過夜,滴加生物素標(biāo)記IgG工作液,37℃孵育30 min,滴加ABC復(fù)合物后37℃孵育20 min,滴加DAB顯色液,37℃10 min,脫水后透明、封膠。采用彩色病理圖像分析儀的圖文分析系統(tǒng)對切片進(jìn)行分析,隨機(jī)選擇3個(gè)視野/切片,雙盲法觀察,讀取平均數(shù)。

        2.3 RT-PCR法分析大鼠子宮內(nèi)膜VEGF mRNA、MMP-9 mRNA的表達(dá)

        將液氮冷凍的大鼠子宮內(nèi)膜組織研成粉末,按試劑盒提取總RNA,用TransScript RT/RI Enzyme Mix合成第一鏈cDNA,DNA擴(kuò)增,RT-PCR反應(yīng)條件為:預(yù)防性94℃,5 min。變性94℃,1 min;退火55℃,1 min;延伸72℃,2 min;共35個(gè)循環(huán),循環(huán)后延伸,72℃,7 min。實(shí)驗(yàn)時(shí)用β-actin作為內(nèi)參。VEGF、MMP-9、β-actin引物見表1。

        表1 RT-PCR 中所用引物序列

        3 結(jié)果

        3.1 各組大鼠子宮內(nèi)膜VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)的影響

        與空白對照組比較,模型對照組的大鼠子宮內(nèi)膜VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)水平均出現(xiàn)顯著性升高(P<0.01),提示子宮內(nèi)膜異常增生,造模成功;與模型對照組比較,二色補(bǔ)血草總黃酮各組VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)水平均有所降低,其中二色補(bǔ)血草總黃酮的高劑量組VEGF蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01),MMP-9的蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。結(jié)果見表2。

        表2 二色補(bǔ)血草總黃酮對大鼠子宮內(nèi)膜VEGF、MMP-9表達(dá)的影響

        注:與空白對照組比較,**P<0.01;與模型對照組比較,△P<0.05,△△P<0.01

        3.2 各組大鼠子宮內(nèi)膜VEGF mRNA、MMP-9 mRNA表達(dá)的影響

        與空白對照組比較,模型對照組大鼠子宮內(nèi)膜VEGF mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),MMP-9 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01);與模型對照組比較,二色補(bǔ)血草總黃酮中、高劑量組VEGF mRNA和MMP-9 mRNA表達(dá)水平均出現(xiàn)明顯降低(P<0.05)。結(jié)果見表3。

        表3 二色補(bǔ)血草總黃酮對大鼠子宮內(nèi)膜VEGF mRNA、MMP-9 mRNA表達(dá)的影響

        注:與空白對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型對照組比較,△P<0.05,△△P<0.01

        4 討論

        ADUB患者由于無孕激素拮抗的雌激素長期刺激,導(dǎo)致子宮內(nèi)膜管腔變大、靜脈毛細(xì)血管增加,提高了血管脆性,其發(fā)展過程與血管生成密切相關(guān)。VEGF主要作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞,是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性有絲分裂原,主要通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合,從而誘導(dǎo)血管生成。VEGF可促進(jìn)微血管擴(kuò)張,增加血管通透性,被認(rèn)為是調(diào)控血管生成作用最強(qiáng)和特異性最高的調(diào)控因子[9-10]。病理情況下,VEGF可引起子宮內(nèi)膜血管過度增生,增加血管滲透性并改變血管結(jié)構(gòu),導(dǎo)致子宮異常出血?;|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一組鋅依賴內(nèi)肽酶類,能降解絕大多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)和膠原,主要表達(dá)在子宮內(nèi)膜腺上皮、間質(zhì)及血管基底膜上[11]。研究表明,子宮內(nèi)膜組織缺乏孕酮時(shí)可促使MMP-9的合成與分泌,而正常生理濃度的孕酮幾乎完全抑制MMP-9的合成與分泌。當(dāng)孕酮撤退,子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞在表皮生長因子和血管生長因子等細(xì)胞因子的作用下,通過旁分泌或自分泌形式產(chǎn)生大量MMP-9。MMP-9過度表達(dá),既增加血管基膜的降解,又促進(jìn)了炎性細(xì)胞的浸潤,導(dǎo)致血管完整性被破壞,并出現(xiàn)炎癥反應(yīng),最終影響子宮內(nèi)膜的正常修復(fù),導(dǎo)致子宮異常性出血。此外,VEGF與其受體KDR結(jié)合可增加MMP-9的表達(dá)水平,從而降解膠原纖維,增加血管脆性增加,進(jìn)一步導(dǎo)致纖維蛋白水解,止血作用下降出現(xiàn)異常出血[12]。

        本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,造模后大鼠VEGF和MMP-9的蛋白和mRNA表達(dá)水平均出現(xiàn)顯著性增加,導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異常增生。給予二色補(bǔ)血草總黃酮后,高劑量組可明顯降低大鼠子宮內(nèi)膜VEGF和MMP-9的蛋白和mRNA表達(dá)水平;中劑量組可明顯降低大鼠子宮內(nèi)膜VEGF、MMP-9的mRNA表達(dá)水平及VEGF的蛋白水平。說明二色補(bǔ)血草總黃酮治療ADUB的機(jī)制可能是通過下調(diào)VEGF的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平,引起MMP-9的表達(dá)水平下降,減輕子宮內(nèi)膜血管脆性從而達(dá)到止血的目的。

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