何煒，冷蓓崢，揭志軍

(復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院，上海　200240)

支氣管哮喘是以氣道慢性炎癥和氣道高反應(yīng)性為主要特征的一種慢性炎癥性疾病。影響了世界上約3億人群，并且其發(fā)病率和嚴(yán)重性正在日益增大。

臨床觀察發(fā)現(xiàn)，玉屏風(fēng)散對(duì)呼吸道疾病有較好的治療作用和預(yù)防作用[1]。玉屏風(fēng)散是一種Th1免疫反應(yīng)刺激劑，但玉屏風(fēng)散對(duì)免疫調(diào)節(jié)治療哮喘的機(jī)制尚不明確。IL-10是炎癥抑制因子，對(duì)IL-4、IL-12等多種炎癥因子具有抑制作用。大量的IL-10可抑制Th2細(xì)胞，從而抑制哮喘和過(guò)敏性疾病。VCAM-1主要在血管內(nèi)皮和上皮細(xì)胞表達(dá)，能特異性介導(dǎo)嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)到肺組織，受IL-4等多種因子的調(diào)節(jié)，在促進(jìn)哮喘的發(fā)生和發(fā)展中起了重要作用[2]。本研究通過(guò)觀察支氣管哮喘模型小鼠肺組織IL-10、VACM-1的mRNA和蛋白表達(dá)，探討玉屏風(fēng)散對(duì)哮喘的干預(yù)作用。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物

健康8周齡雌性Balb/c小鼠40只，體質(zhì)量(23.52±1.27)g，由復(fù)旦大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物部提供(合格證：2009001901569)。飼養(yǎng)在CL級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室(上海市動(dòng)物管理學(xué)會(huì)合格證：20090082)，普通飼料喂養(yǎng)。

1.1.2主要試劑和藥物

卵白蛋白(Sigma公司)；IL-10 ELISA檢測(cè)試劑(Bender Medsystems公司)； Trizol(Invitrogen公司，編號(hào)15596-026)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo公司，#K1622)；PCR試劑(Thermo公司，F(xiàn)-415XL)。

玉屏風(fēng)散水煎劑：按文獻(xiàn)方法運(yùn)用微波技術(shù)提取水煎劑，含玉屏風(fēng)散生藥96.38 mg/ml。

1.2　小鼠模型建立與分組

采用腹腔注射致敏，霧化吸入激發(fā)造模。Balb/c小鼠致敏方法參照文獻(xiàn)報(bào)道[3]。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表，將40只小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。

1.2.1模型組(OVA 組)

第1天給予小鼠腹腔注射0.2 ml致敏液(含OVA 100 μg，氫氧化鋁1 mg)，第14天后重復(fù)致敏一次，激發(fā)于第24～30天,將小鼠置于密閉容器(20 cm×40 cm×50 cm)中 ，以1%的OVA溶液10 ml霧化吸入，每天1次，每次30 min。在最后1次激發(fā)后48 h內(nèi) (第32天)處死小鼠。

1.2.2玉屏風(fēng)組

第1天給予小鼠腹腔注射0.2 ml致敏液，第14天后重復(fù)致敏一次，激發(fā)于第24～30天,將小鼠置于密閉容器，OVA溶液10 ml霧化吸入，每天1次，每次30 min。第24～30天,玉屏風(fēng)灌胃治療，在最后1次激發(fā)后48 h (第32天)處死小鼠。

1.2.3布地奈德組

第1天給予小鼠腹腔注射0.2 ml致敏液，第14天后重復(fù)致敏一次，激發(fā)于第24～30天,將小鼠置于密閉容器，OVA溶液10 ml霧化吸入，在霧化吸入OVA前30 min霧化吸入布地奈德混懸液8 ml，每天1次，每次30 min。在最后1次激發(fā)后48 h(第32天)處死小鼠。

1.2.4對(duì)照組

第1天給予小鼠腹腔注射0.2 ml生理鹽水，第14天后重復(fù)注射一次，激發(fā)于第24～30天,將小鼠置于密閉容器，以1%生理鹽水溶液超聲霧化激發(fā)，每天1次，每次30 min。第24～30天同時(shí)給予純水10 ml/kg灌胃，每天1次，在最后1次激發(fā)后48 h(第32天)處死小鼠。

1.3　標(biāo)本收集

末次激發(fā)24 h后，將4組小鼠進(jìn)行眼球摘除采血。

支氣管肺泡灌洗液(BALF)：小鼠頸前暴露氣管，插入氣管插管針，結(jié)扎右肺門根部，左肺行支氣管肺泡灌洗，收集上清液儲(chǔ)存于-20℃冰箱待測(cè)細(xì)胞因子。

組織總RNA的抽提：結(jié)扎右肺門根部，采用高溫滅酶的剪刀和鑷子取右肺組織置于凍存管，液氮速凍，保存在-80℃冰箱，備RNA抽提。依次將各組組織100 mg轉(zhuǎn)移至5 ml玻璃試管中，每一管中加入1 ml預(yù)冷Trizol；勻漿，每個(gè)樣本勻漿后用75%的酒精棉球擦拭勻漿器， DEPC處理水清洗。轉(zhuǎn)移到無(wú)RNA酶的離心管中。室溫放置5 min，加入氯仿，振蕩，離心15 min。吸出上層水相約500 μl 轉(zhuǎn)移至無(wú)RNA酶的離心管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻6～8次，-20℃冰箱放置30 min。離心15 min，可見(jiàn)RNA沉淀；棄上清，75%乙醇洗滌沉淀，離心5 min，棄上清。重復(fù)步驟一遍，棄上清，吸凈殘存乙醇，自然干燥；20 μl DEPC處理水，溶解RNA，-80℃冰箱，待用。

逆轉(zhuǎn)錄cDNA：將試劑盒從-80℃冰箱取出，復(fù)融，將5×逆轉(zhuǎn)錄buffer，dNTPs，MMLV，oligo(dT)10 000 r/min，數(shù)秒。將經(jīng)過(guò)稀釋后的RNA樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR。

1.4　檢測(cè)項(xiàng)目

雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)IL-10；實(shí)時(shí)熒光定量法(RT-PCR)檢測(cè)肺組織IL-10 mRNA和VCAM-1 mRNA的表達(dá)。

引物由上海基爾頓公司設(shè)計(jì)。引物序列如下：VCAM-1：上游5′GATAGACAGCCCACTAAACG 3′，下游5′TGGAGCCAAACACTTGAC 3′。IL-10： 5′CCTGTGTTTAAGCTGTTTC 3′，下游5′AAGACCCATGAGTTTCTTC 3′。GAPDH：上游5′ATCACTGCCACCCAGAAG 3′，下游5′TCCACGACGGACACATTG 3′。PCR反應(yīng)條件：95℃10 min預(yù)變性后進(jìn)入循環(huán)，95℃變性15 s，退火溫度退火45 s ，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，60℃延伸7 min。

ELISA法檢測(cè)BALF中IL-10蛋白表達(dá)的水平，測(cè)定結(jié)果按照標(biāo)準(zhǔn)曲線換算。

1.5　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1　實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)肺組織IL-10 mRNA和VCAM-1 mRNA的表達(dá)比較

以GAPDH為內(nèi)參照計(jì)算其相對(duì)比值。One-Way ANOVA統(tǒng)計(jì)，模型組，玉屏風(fēng)組，布地奈德組IL-10 mRNA的表達(dá)與對(duì)照組相比明顯增加，有顯著性差異(F=3.78，P<0.05)。玉屏風(fēng)組，布地奈德組VCAM-1 mRNA的表達(dá)與模型組相比明顯降低，有顯著性差異(F=4.84，P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　各組小鼠肺組織IL-10 mRNA和VCAM-1 mRNA水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.2　ELISA法檢測(cè)BALF IL-10的水平比較

采用One-WayANOVA統(tǒng)計(jì)，BALF中IL-10的水平，玉屏風(fēng)組、布地奈德組與模型組相比明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=7.26，P<0.05)，模型組和對(duì)照組相比降低，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，玉屏風(fēng)組和布地奈德組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　ELISA法檢測(cè)BALF中IL-10(pg/ml)的水平比較

注：與模型組比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，￥P<0.05；與布地奈德組比較，#P>0.05

3　討論

哮喘是氣道的慢性非特異性炎癥反應(yīng)，其中部分氣道是以嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致氣道對(duì)外界刺激物高反應(yīng)性,甚至引發(fā)支氣管痙攣。在哮喘氣道炎癥中，輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)產(chǎn)生細(xì)胞因子，可分為Thl和Th2兩種亞型細(xì)胞。Thl細(xì)胞分泌白介素-2、白介素-12和淋巴毒素等，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，殺滅細(xì)胞內(nèi)病原體等。Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5等，主要介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，抑制單核-巨噬細(xì)胞的激活等，導(dǎo)致疾病發(fā)生和加劇。研究表明，Th2細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)的Thl/Th2失平衡是哮喘發(fā)病的一個(gè)重要原因。

玉屏風(fēng)散是一種Th1免疫反應(yīng)刺激劑，而玉屏風(fēng)散對(duì)免疫調(diào)節(jié)治療哮喘的機(jī)制尚不明確。小鼠白介素-10是炎癥抑制因子，對(duì)IL-4、IL-12等多種炎癥因子具有抑制作用。大量的IL-10可抑制Th2細(xì)胞，從而抑制哮喘和過(guò)敏性疾病。

本次試驗(yàn)中，模型組，玉屏風(fēng)組，布地奈德組IL-10 mRNA的表達(dá)與對(duì)照組相比明顯增加，有顯著性差異。

關(guān)于IL-10在哮喘中的異常表達(dá)尚無(wú)定論。Simon等發(fā)現(xiàn)[4]，重度哮喘患者BALF中IL-10高于哮喘穩(wěn)定期和正常對(duì)照組。但更多研究顯示，哮喘發(fā)作時(shí)IL-10水平降低[5]。過(guò)敏性和非過(guò)敏性哮喘患兒與正常對(duì)照組比較,外周血T 細(xì)胞表達(dá)IL-10 mRNA都降低[6]。本實(shí)驗(yàn)中哮喘組小鼠治療后，IL-10水平普遍升高。可能是特異性免疫治療后，抗原特異性T 細(xì)胞分泌IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β明顯增加[7]，抑制T細(xì)胞增殖反應(yīng)和IL-4、IL-5、IL-13 分泌，降低對(duì)突變?cè)磻?yīng)性。IL-10在治療后上升，增強(qiáng)特異性T細(xì)胞免疫耐受和免疫抑制。因此IL-10水平可能提示哮喘治療的敏感性和預(yù)后。

在復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)中，IL-10是一個(gè)極其重要的細(xì)胞因子，具有抗炎癥作用，能緩解過(guò)敏的氣道炎癥[8]。本實(shí)驗(yàn)在小鼠激發(fā)的同時(shí)給予玉屏風(fēng)散灌胃，結(jié)果顯示玉屏風(fēng)組，布地奈德組IL-10 mRNA的表達(dá)與對(duì)照組相比有明顯增加，差異有顯著性。BALF中IL-10的含量，也是升高的。說(shuō)明致敏的小鼠用一定劑量的玉屏風(fēng)散，可以升高IL-10的水平，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫，對(duì)支氣管哮喘氣道炎癥，有一定的緩解作用。

哮喘患者肺組織中的嗜酸性粒細(xì)胞炎癥是呼吸道變應(yīng)性炎癥的一個(gè)重要特征。VCAM-1作為一種特異性介導(dǎo)嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)到支氣管黏膜，甚至到肺組織的黏附分子，在哮喘中可能扮演了另一個(gè)重要的角色。本次試驗(yàn)中，玉屏風(fēng)組，布地奈德組VCAM-1 mRNA的表達(dá)與模型組比較明顯降低，有顯著性差異。

有報(bào)道稱[9-10]，可溶性黏附分子，可以預(yù)示炎癥存在，血液中可溶性黏附分子主要來(lái)源于細(xì)胞膜黏附分子的脫落，另一部分來(lái)自受損細(xì)胞的細(xì)胞黏附分子的分泌。在對(duì)支氣管哮喘急性發(fā)作患兒研究中發(fā)現(xiàn)，VCAM-1顯著升高，但在疾病緩解期降低。在過(guò)敏原刺激后18 h的哮喘患者BALF液中，VCAM-1水平增高。與支氣管哮喘緩解期患者相比，哮喘急性發(fā)作期時(shí)，外周血中VCAM-1水平呈顯著性增加。處于支氣管哮喘急性期患者，其血液和BALF中可溶性黏附分子濃度升高[11-12]，反映了這個(gè)階段呼吸道廣泛性的炎癥反應(yīng)。本次實(shí)驗(yàn)，激發(fā)的模型組小鼠VCAM-1 mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯升高。在小鼠激發(fā)的同時(shí)給予玉屏風(fēng)散灌胃，結(jié)果顯示玉屏風(fēng)組，布地奈德組VCAM-1 mRNA的表達(dá)與模型組相比明顯降低，差異有顯著性。說(shuō)明細(xì)胞黏附分子在支氣管哮喘的炎癥形成和氣道高反應(yīng)性中起了重要的作用[13-14]。玉屏風(fēng)組降低VCAM-1水平，參加機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)，緩解哮喘發(fā)作[10]。

糖皮質(zhì)激素作為經(jīng)典藥物目前仍是哮喘主要治療手段[15]，但長(zhǎng)期應(yīng)用存在大量的副作用。本次實(shí)驗(yàn)中，玉屏風(fēng)組和布地奈德組在IL-10 mRNA，VCAM-1 mRNA表達(dá)上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可見(jiàn)哮喘治療后，IL-10 水平普遍升高，不論應(yīng)用玉屏風(fēng)散灌胃或霧化吸入布地奈德，均可顯著提升炎癥抑制因子的表達(dá)。IL-10能明顯拮抗過(guò)敏性炎癥。本次實(shí)驗(yàn)中卵蛋白激發(fā)小鼠的時(shí)間短，樣本量不多，雖不能與臨床實(shí)際完全符合，但玉屏風(fēng)散相對(duì)于糖皮質(zhì)激素而言，副作用小，臨床安全性高，為臨床治療哮喘提供了一個(gè)新的思路。