張玉昆，馮月男，卞敬琦，遲文成，隋雨桐，姜廣坤，牛雯穎，姜慶輝，李陸軍*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江　哈爾濱　150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江　哈爾濱　150040)

肝纖維化是諸多致病因素導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生壞死、凋亡及炎癥反應(yīng)時(shí)，肝內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生與沉積的病理過(guò)程，是慢性肝病重要的病理特征，也是進(jìn)一步向肝纖維化發(fā)展的主要中間環(huán)節(jié)[1]。當(dāng)前研究結(jié)果認(rèn)為,肝炎病毒、血吸蟲(chóng)感染、酒精損傷、藥物代謝、膽汁淤積、化學(xué)中毒、代謝障礙等均可引起肝纖維化。大量研究表明，肝星狀細(xì)胞(HSC)的活化與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)代謝失衡是肝纖維化的重要機(jī)制，已經(jīng)證實(shí)ECM來(lái)源于HSC，HSC活化后分泌大量ECM，造成ECM代謝失衡，進(jìn)而形成肝纖維化。

龍牙楤木又名遼東楤木，為五加科植物龍牙楤木[Araliaelata(Miq.)Seem.]的干燥根皮及莖皮[2]。龍牙肝泰膠囊是將龍牙楤木根、莖皮粉碎成粗粉，加90%乙醇加熱回流提取等工藝制成的膠囊劑，龍牙肝泰膠囊作為純中藥制劑，上市近15年，患者群累計(jì)超過(guò)500萬(wàn)人。對(duì)患者群用藥效果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，龍牙肝泰膠囊對(duì)病毒性肝損傷、酒精性肝損傷有顯著的保肝護(hù)肝作用，對(duì)脂肪肝、肝纖維化、肝腹水等病癥與其他藥物配合使用有明顯的治療改善作用[3-4]。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察肝纖維化模型大鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、透明質(zhì)酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅳ型膠原(CⅣ)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、肝組織病理組織學(xué)檢查的改變以及肝臟組織中金屬蛋白酶抑制劑(TIMP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-1)水平,探討龍牙肝泰膠囊抗肝纖維化的作用機(jī)制，為臨床用藥提供指導(dǎo)。

1　材料與儀器

1.1　藥品與試劑

葵花護(hù)肝片(陽(yáng)性對(duì)照藥物，黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司)；龍牙肝泰膠囊(實(shí)驗(yàn)受試藥物，黑龍江久久藥業(yè)有限責(zé)任公司)；AST、ALT測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；大鼠血清HA、LN、CⅣ和PCⅢ酶聯(lián)免疫試劑盒(南京安培化工科技有限公司)；TIMP-1、MMP-1試劑盒(上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司)；四氯化碳(CCl4,分析純，沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠)。

1.2　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雄性大鼠，體質(zhì)量160～180 g，室溫飼養(yǎng)，自由進(jìn)食。由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)GLP)提供，動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK(黑)200804001。

1.3　實(shí)驗(yàn)儀器

分析天平(梅特勒)；魅力2000全自動(dòng)生化分析儀；博塞全自動(dòng)酶標(biāo)儀；moticam 3000顯微攝影成像系統(tǒng)(美國(guó)motic公司)；Image-pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1　實(shí)驗(yàn)分組

取SD大鼠60只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為龍牙肝泰膠囊高、中、低劑量組，正常對(duì)照組(空白組)，纖維化組(模型組)，葵花護(hù)肝片對(duì)照組(陽(yáng)對(duì)組)，每組10只，共6組。

2.2　模型建立與給藥方案

每日上午8時(shí)左右，除空白組外，其余各組動(dòng)物，按1 ml/kg體質(zhì)量灌胃給予油劑CCl4，將CCl4與橄欖油等比例混合配成50%的油劑CCl4，每周灌胃2次，每周稱重，按體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量；空白組按1 ml/kg體質(zhì)量灌胃給予橄欖油，持續(xù)8周。每日下午15時(shí)左右給予藥物干預(yù)，每周5次，持續(xù)8周。各組給藥劑量分別為：低劑量組42 mg/kg，中劑量組84 mg/kg，高劑量組168 mg/kg，陽(yáng)對(duì)組545 mg/kg；模型組與空白組動(dòng)物按10 ml/kg體質(zhì)量給予生理鹽水。

2.3　指標(biāo)檢測(cè)

末次給藥2 h后，乙醚麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心制備血清，測(cè)定血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、透明質(zhì)酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅳ型膠原(CⅣ)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)水平,取肝臟組織部分液氮冷凍(-70℃保存),測(cè)定TIMP-1、MMP-1水平，另一部分用10%福爾馬林固定進(jìn)行病理學(xué)檢查。

2.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS16.0軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果用均值加減標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，P≤0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3　結(jié)果

3.1　龍牙肝泰膠囊對(duì)肝纖維化大鼠肝功能的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,模型組與空白組比較，大鼠血清中AST、ALT水平極顯著性升高(P<0.01)；龍牙肝泰膠囊各劑量組、陽(yáng)對(duì)組與模型組比較，血清中AST、ALT水平均極顯著性降低(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　龍牙肝泰膠囊對(duì)肝纖維化大鼠血清中AST、ALT水平的影響

注：與模型組比較，P<0.01；與空白組比較，P<0.01

3.2　龍牙肝泰膠囊對(duì)大鼠血清中肝纖維化標(biāo)志物的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組與空白組比較，血清中肝纖維化標(biāo)志物中HA、LN、CⅣ、PCⅢ水平均極顯著性升高(P<0.01)。與模型組比較，高劑量組、陽(yáng)對(duì)組，能極顯著性降低肝纖維化大鼠血清中HA、LN、CⅣ水平(P<0.01)，顯著性降低PCⅢ水平(P<0.05)；中劑量組能極顯著性降低肝纖維化大鼠血清中HA水平，顯著性降低LN、CⅣ水平(P<0.05)，對(duì)PCⅢ水平有降低的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；低劑量組能顯著性降低肝纖維化大鼠血清中HA水平(P<0.05)，對(duì)LN、CⅣ、PCⅢ水平有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　龍牙肝泰膠囊對(duì)肝纖維化大鼠血清中HA、LN、CⅣ、PCⅢ水平的影響

注：與模型組比較，P<0.01，P<0.05；與空白組比較，P<0.01

3.3　龍牙肝泰膠囊對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中TIMP-1、MMP-1水平的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,模型組與空白組比較，大鼠肝臟組織中TIMP-1水平顯著性升高(P<0.05)；陽(yáng)對(duì)組、高劑量組與模型組比較,大鼠肝組織中TIMP-1水平顯著性降低(P<0.05)；中、低劑量組大鼠肝組織中TIMP-1水平有降低的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組與空白組比較，大鼠肝臟組織中MMP-1水平極顯著性降低(P<0.01)；陽(yáng)對(duì)組與模型組比較,肝纖維化大鼠肝組織中MMP-1水平顯著性升高(P<0.05)；高劑量與模型組比較,肝纖維化大鼠肝組織中MMP-1水平極顯著性升高(P<0.01)；中、低劑量組與模型組比較,肝纖維化大鼠肝組織中MMP-1水平有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　龍牙肝泰膠囊對(duì)肝纖維化大鼠肝臟組織中TIMP-1、MMP-1水平的影響

注：與模型組比較，P<0.01,*P<0.05；與空白組比較，P<0.01,△P<0.05

3.4　龍牙肝泰膠囊對(duì)肝纖維化大鼠肝臟組織病理學(xué)的影響結(jié)果

空白組：細(xì)胞排列整齊，界限清晰，細(xì)胞核正常，無(wú)胞質(zhì)融合，無(wú)纖維化，無(wú)炎性細(xì)胞，見(jiàn)圖1。

模型組：細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核界限不清晰，細(xì)胞核固縮，胞質(zhì)融合，呈現(xiàn)脂肪變性，局部出現(xiàn)纖維化，呈彌散性病變，散在許多血細(xì)胞及炎細(xì)胞，見(jiàn)圖2。

陽(yáng)對(duì)組：細(xì)胞排列基本整齊，細(xì)胞核成圓形，肝細(xì)胞無(wú)變性壞死，少見(jiàn)炎性細(xì)胞，見(jiàn)圖3。

高劑量組：細(xì)胞排列整齊，界限清晰，細(xì)胞核呈圓形，無(wú)胞質(zhì)融合，無(wú)肝細(xì)胞壞死變性，見(jiàn)圖4。

中劑量組：細(xì)胞排列略有紊亂，胞質(zhì)見(jiàn)少量融合，胞漿呈疏松，見(jiàn)炎性細(xì)胞及變性細(xì)胞，見(jiàn)圖5。

低劑量組：細(xì)胞排列不齊，界限不清，細(xì)胞核大多呈圓形，局部纖維化及少量血細(xì)胞，見(jiàn)圖6。

圖1　空白組HE染色圖(400×)

圖2　模型組HE染色圖(400×)

圖3　陽(yáng)對(duì)組HE染色圖(400×)

圖4　高劑量組HE染色圖(400×)

圖5　中劑量組HE染色圖(400×)

圖6　低劑量組HE染色圖(400×)

4　討論

肝纖維化是肝臟組織大量膠原沉著富集為特點(diǎn)的病變，多數(shù)肝纖維化過(guò)程中，都伴隨著肝細(xì)胞的損傷、變性、壞死等病理改變[5]。CCl4慢性中毒所致肝纖維化與臨床肝纖維化形成的過(guò)程極為相似，主要包括過(guò)氧化反應(yīng)、肝組織酶的活化、炎癥反應(yīng)等。上述反應(yīng)均可引起細(xì)胞損傷，肝細(xì)胞代謝失衡。病生理指標(biāo)表現(xiàn)為谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平的升高、肝纖維化標(biāo)志物HA、LN、CⅣ、PCⅢ水平升高等。這一系列性的改變與肝星狀細(xì)胞(HSC)的活化與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)代謝失衡密切相關(guān)。當(dāng)過(guò)量的ECM產(chǎn)生時(shí)，會(huì)被金屬蛋白酶抑制劑(MMP)降解，同時(shí)基質(zhì)金屬蛋白酶(TIMP)又能抑制MMP的活性，所以，MMP與TIMP之間的平衡穩(wěn)定是保護(hù)肝細(xì)胞正常的前提[6]。

龍牙肝泰膠囊內(nèi)容物是龍牙楤木醇提物，主要成分是皂苷，水解后的苷元以齊墩果酸為主。研究發(fā)現(xiàn),龍牙楤木醇提物具有抗炎、抗腫瘤、保肝、護(hù)肝等藥理作用[7-8]。作為純中藥制劑，龍牙肝泰膠囊已在市場(chǎng)銷售15年，降酶保肝作用顯著，對(duì)肝纖維化、脂肪肝、肝硬化療效顯著。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)肝纖維化大鼠模型肝功能、肝纖維化標(biāo)志物、病理檢查以及肝組織中MMP-1與TIMP等指標(biāo)的系統(tǒng)性研究可以發(fā)現(xiàn),龍牙肝泰膠囊對(duì)肝纖維化大鼠有明顯的治療作用，其作用機(jī)制可能與維持肝細(xì)胞的穩(wěn)定性、降低肝細(xì)胞損傷、各型膠原的累積、穩(wěn)定HSC的活化、使金屬蛋白抑制劑與基質(zhì)金屬蛋白酶處于動(dòng)態(tài)平衡等相關(guān)。肝纖維化致病因素與形成過(guò)程還尚未完全明確，故對(duì)龍牙肝泰膠囊的藥理作用與臨床適用證的增加也有待進(jìn)一步研究探討。