秦合偉，李彥杰，任錕，張志鑫，趙晶，邢若星，原箏

(河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院)，河南　鄭州　450002)

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是心腦血管疾病最主要的病理改變基礎(chǔ)。目前研究認(rèn)為,AS的發(fā)生發(fā)展與內(nèi)皮細(xì)胞損傷、脂質(zhì)紊亂、免疫應(yīng)答和與其相關(guān)的慢性炎癥反應(yīng)密切關(guān)系[1-2]。Toll樣受體(toll like receptors,TLRs)在天然免疫反應(yīng)和獲得性免疫反應(yīng)中均具有重要作用，研究表明TLRs與配體結(jié)合后迅速二聚化，通過募集大量銜接蛋白而活化受體，啟動(dòng)固有免疫系統(tǒng)，同時(shí)也可激活適應(yīng)性免疫，Toll樣受體9(Toll-like receptor 9,TLR9)是TLRs家族中重要的一員，在固有免疫和獲得性免疫應(yīng)答中都具有重要的作用，TLR9可通過影響巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)從而影響AS的形成[3-4]。本研究旨在觀察血管軟化丸通過對(duì)TLR9調(diào)控，影響其TLR9下游信號(hào)NF-κB和IRF7水平，以及對(duì)巨噬細(xì)胞(M2/M1)的極化平衡狀態(tài)的影響，揭示血管軟化丸抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1　細(xì)胞與動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)所用小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7均來源于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。本實(shí)驗(yàn)所用C57BL/6J小鼠(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所)12只作為正常組。ApoE-/-小鼠(南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所)共48只，SPF級(jí)，8周齡，體質(zhì)量(18±2)g，雄性，隨機(jī)分為ODN組、IRS組、中劑量組、高劑量組，每組12只。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2　藥物與試劑

血管軟化丸組方[5]：山楂30 g，建曲30 g，萊菔子15 g，陳皮12 g，清半夏9 g，茯苓15 g，連翹12 g，郁金12 g，枸杞子15 g，三七12 g，珍珠30 g，代赭石30 g。所用中藥均來源于河南省中醫(yī)院藥劑科，通過醫(yī)院煎藥房煎煮和濃縮成不同濃度的湯劑(血管軟化丸高劑量：濃度為3.456 g/mL；血管軟化丸中劑量：濃度為1.728 g/mL)。

ODN1826和IRS869(上海生工生物工程股份有限公司)；抗體NF-κB p65、NF-κB、TLR9、CD206、MyD88、CD68、IRF7(美國(guó)Abcam公司)；抗體iNOS、α-actin(Santa公司)；RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)；總RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司)；細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒(碧云天公司)；ELISA試劑盒(eBioscience)；其他化學(xué)試劑均由河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.3　血管軟化丸含藥血清的制備

SD大鼠20只分為空白組(不用藥)和血管軟化丸組?？瞻捉M給予蒸餾水灌胃，血管軟化丸組給予1 g/mL的血管軟化丸灌胃，連續(xù)灌胃1周后經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，應(yīng)用高速離心機(jī)12 000 g/min離心，離心后取上清液，56℃溫度滅活，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4　細(xì)胞培養(yǎng)分組及藥物血清處理

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7用含10%滅活胎牛血清以及雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，待48 h后更換培養(yǎng)基，細(xì)胞用細(xì)胞刮傳代，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。當(dāng)細(xì)胞密度長(zhǎng)至70%時(shí)，換成0.2%低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，然后加相應(yīng)刺激。實(shí)驗(yàn)主要分為對(duì)照組(空白血清)、血管軟化丸中劑量組、血管軟化丸高劑量組、IRS組(TLR9拮抗劑：IRS869)、ODN組(激動(dòng)劑：ODN1826)。

1.5　Western Blot檢測(cè)各組RAW264.7細(xì)胞TLR9蛋白的表達(dá)

收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，用蛋白裂解液裂解總蛋白，提取蛋白，經(jīng)定量后，加入緩沖液，加熱使蛋白質(zhì)變性，電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉，加入相應(yīng)濃度的一抗，4℃孵育過夜，TBST洗滌3次。加入二抗，室溫孵育，TBST洗滌3次。用堿磷酶化學(xué)發(fā)光進(jìn)行顯色。使用ImageJ軟件分析條帶灰度值[6]。

1.6　巨噬細(xì)胞表型的檢測(cè)

采用免疫熒光雙標(biāo)化學(xué)染色檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞iNOS和CD206蛋白表達(dá)量，具體方法按照說明書步驟進(jìn)行。

1.7　巨噬細(xì)胞相關(guān)炎癥因子的檢測(cè)

1.7.1RT-PCR法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞中TNF-α mRNA的含量

巨噬細(xì)胞總RNA分離提取，使用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。TNF-α的引物序列為：上游引物5’-ACTCGCCACTCTCGACTCAAG -3’，下游引物5 ’-GACGGTGCCC GAGGCCAGAC-3’；具體方法按說明書步驟進(jìn)行。采用比較CT值法對(duì)樣品擴(kuò)增的CT值進(jìn)行計(jì)算，再按照以下方法計(jì)算出各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量：△CT=目的基因CT-內(nèi)參CT；△△CT=觀察樣本△CT-對(duì)照樣本△CT；樣本的相對(duì)表達(dá)量=2-△△CT。

1.7.2ELISA法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α的濃度

當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)期時(shí)，刮下細(xì)胞，吸管吹勻，種到六孔板中，細(xì)胞貼壁12 h后，換成0.2%血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后刺激干預(yù)；留取六孔板中各組的培養(yǎng)基，放到4℃離心機(jī)，3 500 rpm離心6 min，將上清用移液槍轉(zhuǎn)移至另一個(gè)EP管中以備用。檢測(cè)具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，得出各組的OD值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度和相應(yīng)的OD值為參數(shù)，直線回歸處理，得出相應(yīng)的方程，算出各組的濃度。

1.8　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1.8.1動(dòng)物造模與灌胃

所有小鼠自由飲水，給于普通飼料飼養(yǎng)1周后分別采用不同飼料飼養(yǎng)，ApoE-/-小鼠采用高脂飼料(含脂肪21%、膽固醇0.15%)飼養(yǎng)。C57BL/6J小鼠12只作為正常組，于飼養(yǎng)4周后將48只ApoE-/-小鼠按照隨機(jī)分組方法分為4組：IRS組(IRS869，腹腔注射)、ODN組(ODN1826，腹腔注射)、血管軟化丸中劑量組(濃度為1.728 g/mL)、血管軟化丸高劑量組(濃度為3.456 g/mL)，每組12只，于12周齡起，對(duì)照組給予等體積生理鹽水灌胃；中藥組分別給予血管軟化丸高劑量(3.456 g/mL)和血管軟化丸中劑量(1.728 g/mL)灌胃。腹腔注射每周2次，灌胃每日1次，連續(xù)給藥8周后取材進(jìn)行檢測(cè)。

1.8.2樣品采集與處理

所有要取材動(dòng)物禁食12 h，采用眼眶取血法采血，按摩心臟部位，用離心管收集血液，低速離心，分離血清，冷凍保存。采血結(jié)束后脫頸椎處死，刨腹，分離主動(dòng)脈(主動(dòng)脈弓至腹主動(dòng)脈)，用10%多聚甲醛固定主動(dòng)脈6 h，主動(dòng)脈經(jīng)過乙醇梯度脫水、透明、浸蠟包埋后切片。

1.8.3病理學(xué)切片觀察

主動(dòng)脈經(jīng)過乙醇梯度脫水、透明、浸蠟包埋后切片，厚度設(shè)定為4 μm，采用常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色法進(jìn)行切片染色，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察[7]。

1.8.4Western Blot法檢測(cè)斑塊TLR9及其下游分子的蛋白表達(dá)

檢測(cè)主動(dòng)脈斑塊中的TLR9(1:500)、MyD88(1:1 000)、NF-κB(1:1 000)、p-NF-κB(1:500)、IRF7(1:1000)、iNOS(1:200)和CD206(1:50)的蛋白相對(duì)表達(dá)量。具體步驟同細(xì)胞的Western Blot法。

1.8.5iNOS和CD206表達(dá)的檢測(cè)

采用免疫熒光雙標(biāo)化學(xué)染色檢測(cè)各組動(dòng)脈斑塊iNOS和CD206的表達(dá)，具體方法按照說明書步驟進(jìn)行。

1.9　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

飼養(yǎng)和灌胃過程中C57BL/6/J小鼠死亡4只(因相互撕咬導(dǎo)致死亡2只，灌胃操作不當(dāng)導(dǎo)致死亡2只)，ApoE-/-小鼠死亡3只(因相互撕咬導(dǎo)致死亡2只，灌胃操作不當(dāng)導(dǎo)致死亡3只)，剔除離群值，最后進(jìn)入統(tǒng)計(jì)的各組小鼠數(shù)量為10只。

2.1　血管軟化丸對(duì)TLR9及其下游信號(hào)分子蛋白表達(dá)水平的影響

2.1.1血管軟化丸對(duì)RAW264.7細(xì)胞和主動(dòng)脈斑塊TLR9蛋白表達(dá)水平的影響

藥物干預(yù)后，ODN組細(xì)胞的TLR9蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，各中藥組和IRS組細(xì)胞的TLR9蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)。結(jié)果見表1、圖1。

表1　血管軟化丸對(duì)RAW264.7細(xì)胞和主動(dòng)脈斑塊TLR9蛋白表達(dá)水平的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與ODN組比較，△P<0.05

圖1　各組小鼠TLR9蛋白表達(dá)

2.1.2血管軟化丸對(duì)主動(dòng)脈斑塊TLR9下游信號(hào)分子蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，ODN組的MyD88、p-NF-κB、IRF7蛋白表達(dá)水平相對(duì)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各中藥組和IRS組細(xì)胞的MyD88、p-NF-κB、IRF7蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表2、圖2。

表2　血管軟化丸對(duì)主動(dòng)脈斑塊TLR9信號(hào)通路下游信號(hào)分子蛋白表達(dá)的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與ODN組比較，ΔP<0.05

圖2　各組小鼠TLR9蛋白表達(dá)

2.2　血管軟化丸對(duì)巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的影響

2.2.1含藥血清和TLR9對(duì)巨噬細(xì)胞(M2/M1)的極化狀態(tài)的影響

通過血管軟化丸含藥血清、TLR9的激動(dòng)劑和TLR9拮抗劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行刺激，觀察含藥血清和TLR9對(duì)巨噬細(xì)胞(M2/M1)的極化狀態(tài)的影響。采用免疫熒光雙標(biāo)染色法檢測(cè)iNOS和CD206蛋白的表達(dá)。

結(jié)果表明，ODN1826能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞高表達(dá)M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志iNOS，而血管軟化丸含藥血清和IRS869可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞高表達(dá)M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志CD206。差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見圖3，表3。

表3　血管軟化丸含藥血清對(duì)巨噬細(xì)胞iNOS和CD206免疫熒光陽性比率的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與ODN組比較，ΔP<0.05

2.2.2應(yīng)用免疫熒光檢測(cè)各組動(dòng)脈斑塊iNOS和CD206的表達(dá)

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與ODN組相比，各中藥組和IRS組斑塊中iNOS的熒光密度低表達(dá)，而CD206的熒光密度為高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表4。

圖3　含藥血清和TLR9對(duì)巨噬細(xì)胞(M2/M1)極化狀態(tài)的影響(光學(xué)顯微鏡，200×)注：A：對(duì)照組；B：ODN組；C：IRS組；D：中劑量組；E：高劑量組

圖4　各組小鼠主動(dòng)脈病理學(xué)改變(光學(xué)顯微鏡，200×)注：1：對(duì)照組；2：ODN組；3：IRS組；4：中劑量組；5：高劑量組

組別niNOSCD206對(duì)照組100.51±0.060.51±0.06ODN組100.75±0.08*0.11±0.02*IRS組100.32±0.04*Δ0.26±0.04*Δ中劑量組100.45±0.04*Δ0.29±0.03*Δ高劑量組100.42±0.07*Δ0.28±0.03*Δ

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與ODN組比較，ΔP<0.05

2.3　血管軟化丸對(duì)巨噬細(xì)胞(M1/M2)相關(guān)炎癥因子的影響

通過血管軟化丸含藥血清和TLR9的激動(dòng)劑與拮抗劑來干預(yù)RAW264.7細(xì)胞24 h后，RT-PCR法檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ODN組的TNF-α mRNA表達(dá)明顯較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與ODN組比較，各中藥組和IRS組TNF-α mRNA表達(dá)明顯較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

用ELISA法檢測(cè)各組培養(yǎng)基中TNF-α的濃度(pg/ml)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ODN組的TNF-α mRNA表達(dá)明顯較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與ODN組比較，各中藥組和IRS組TNF-α mRNA表達(dá)明顯較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表5。

2.4　各組小鼠主動(dòng)脈病理形態(tài)觀察

在光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn):1)正常組：小鼠主動(dòng)脈壁厚薄均勻，主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑平整，內(nèi)膜各層結(jié)構(gòu)正常，未發(fā)現(xiàn)明顯的動(dòng)脈粥樣硬化病灶。2)ODN組：小鼠主動(dòng)脈管腔不平，主動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增厚；可發(fā)現(xiàn)明顯的動(dòng)脈粥樣斑塊。3)IRS組和中藥組：主動(dòng)脈壁各層結(jié)構(gòu)正常，局部可見小灶性的鈣化顆粒物沉積，可見較小斑塊，病變程度明顯較輕。結(jié)果見圖3。

表5　血管軟化丸對(duì)巨噬細(xì)胞相關(guān)炎癥因子TNF-α的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與ODN組比較，△P<0.05

3　討論

動(dòng)脈粥樣硬化作為心腦血管疾病最常見和最基本的病理改變，是一個(gè)長(zhǎng)期綜合性的病理過程，動(dòng)脈粥樣硬化病理機(jī)制尚未十分明確，一般認(rèn)為與患者脂代謝異常、高血壓、糖尿病和吸煙等因素有關(guān)。關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制，有脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說、血栓形成學(xué)說、平滑肌細(xì)胞克隆學(xué)說、炎癥反應(yīng)學(xué)說、免疫細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和肥大細(xì)胞等)浸潤(rùn)、LDL受體缺失學(xué)說、損傷應(yīng)答學(xué)說、剪切應(yīng)力學(xué)說等。巨噬細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中最典型的炎癥細(xì)胞，參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。巨噬細(xì)胞可活化為2種不同的亞型：M1型和M2型。M1型是經(jīng)典激活型，具有促炎作用；M2型是替代激活型，具有抗炎作用[8]，巨噬細(xì)胞的功能由極化狀態(tài)(M1/M2)決定。研究發(fā)現(xiàn),動(dòng)脈粥樣硬化與心外膜脂肪組織中的巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)有密切關(guān)系[9]，巨噬細(xì)胞通過上調(diào)其TLRs表達(dá)影響巨噬細(xì)胞活化表型[10-11]。TLR9是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的一種重要的模式識(shí)別受體，主要分布于巨噬細(xì)胞、血液中的B細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞。IRS作為一類免疫調(diào)節(jié)DNA序列，能夠有效抑制TLR9的激活[12]。ISS可通過激活TLR9進(jìn)而引起Thl/ Th2類細(xì)胞因子的平衡偏離[13]，所以TLR9表達(dá)水平的改變可能與巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)存在一定的相關(guān)性。近年來，中醫(yī)藥在防治動(dòng)脈粥樣硬化的研究中取得了一定的進(jìn)展，然而對(duì)中醫(yī)藥防治動(dòng)脈粥樣硬化的具體作用機(jī)制還不十分明確。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，大多數(shù)慢性病患病日久，往往逐漸出現(xiàn)血瘀之癥，即“久病必瘀”，其“瘀”可以為血瘀亦可為痰瘀互結(jié),追其源流，古人早有論述?！端貑柋哉摗分赋觯骸安【萌肷?，營(yíng)衛(wèi)行澀，經(jīng)絡(luò)失疏故不同?！敝斓は?“久病必瘀”，葉天士曰:“大凡經(jīng)主氣，以絡(luò)主血，久病血瘀”。當(dāng)今社會(huì)，民食多以甘美，待客多飲酒釀，嗜煙草者眾，“飲食自倍，脾胃乃傷”，加之勞心思慮，郁怒在所難免，因此病多虛中挾實(shí)，治病不宜純補(bǔ)，宜“寓補(bǔ)于消，以消代補(bǔ)”，消者去其雍也。結(jié)合中醫(yī)基礎(chǔ)理論和臨床研究，我們認(rèn)為痰瘀阻滯是動(dòng)脈粥樣硬化的主要證型，李鯉教授創(chuàng)立“血管軟化丸”即有此意。血管軟化丸[5]由山楂、建曲、萊菔子、陳皮、清半夏、茯苓、連翹、郁金、枸杞子、三七、珍珠、代赭石組成。方中山楂消食導(dǎo)滯為君藥；神曲消食健胃祛除酒食陳腐之積；萊菔子長(zhǎng)于下氣除脹，消食除積；半夏和茯苓健脾除濕化痰；郁金、三七解郁行氣，化瘀散結(jié)；枸杞滋補(bǔ)肝腎以固本；珍珠母和代赭石平肝潛陽，降逆祛痰，共為臣藥；陳皮理氣和中為佐藥；甘草調(diào)和諸藥為使。諸藥合用，共奏消積化痰，活血化瘀，平肝潛陽之功。

本實(shí)驗(yàn)旨在觀察血管軟化丸通過對(duì)TLR9調(diào)控，影響其TLR9下游信號(hào)NF-κB和IRF7水平，以及對(duì)巨噬細(xì)胞(M2/M1)極化平衡狀態(tài)的影響，從分子、細(xì)胞和組織等多層次多靶點(diǎn)揭示中藥復(fù)方血管軟化丸防治AS的分子機(jī)制。研究結(jié)果顯示,在血管軟化丸作用下，與對(duì)照組RAW264.7細(xì)胞相比，中藥組TLR9蛋白表達(dá)量明顯下降，動(dòng)脈斑塊的TLR9、MyD88、p-NF-κB和IRF7蛋白表達(dá)量均明顯降低。ODN組M1型巨噬細(xì)胞比例相對(duì)增加，各中藥組和IRS組M2型比例相對(duì)增加。各中藥組和IRS組動(dòng)脈斑塊的CD206/iNOS比值相對(duì)增加，斑塊M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)炎癥因子(IL-1β,iNOS,Ciita)表達(dá)相對(duì)降低，M2型相關(guān)炎癥因子(Ym1,Fizz1)表達(dá)相對(duì)升高。在RAW264.7細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，中藥和IRS可逆轉(zhuǎn)ODN1826引起的TNF-α的升高，使其降低。同時(shí)，各中藥組斑塊形成和面積相對(duì)較少，血管軟化丸抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用得到驗(yàn)證。以上研究表明，血管軟化丸和TLR9的拮抗劑IRS869可抑制TLR9的表達(dá)，阻止其下游信號(hào)NF-κB和IRF7的激活，進(jìn)而改變巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)(M2/M1)的平衡使其向M2型方向傾斜，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，我們推測(cè)這是血管軟化丸抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制之一。