趙玉璽，魏瑩，陳釧，楊蘭，張帆

(川北醫(yī)學院藥學院,藥物研究所，四川　南充　637000)

惡性腫瘤已經(jīng)成為威脅人類生命安全的第二大疾病，目前呈高發(fā)趨勢[1-2]。常規(guī)化療藥物在腫瘤部位濃度低、選擇性差、對正常的組織或器官可產(chǎn)生明顯的毒性作用，從而引起嚴重不良反應[3-4]。中藥作為天然產(chǎn)物，具有效果好、不良反應少、抗藥性低等特點，目前從中藥成分中探索抗腫瘤作用，已經(jīng)成為研究熱點[5-7]。咖啡酸(caffeic acid,CA)是一種酚酸類化合物[8]，化學名為3-(3，4-二羥基苯基)-2-丙烯酸，廣泛存在于小薊、金銀花、杜仲、牛至、茵陳蒿、蒲公英等多種藥用植物中，其藥理作用包括心血管保護、抗氧化[9]、抗病毒等[10]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，咖啡酸及其衍生物還具有抗腫瘤的作用，對肝癌[11]、結(jié)腸癌[12]、口腔癌[13]等多種癌癥均有抑制作用。但咖啡酸是脂溶性藥物，體內(nèi)吸收差，使其臨床應用受到很大的阻礙。脂質(zhì)體是一種具有良好生物相容性的納米遞藥系統(tǒng)[14]，脂質(zhì)體包封脂溶性藥物可以有效地提高其在體內(nèi)的生物利用度，增強療效，同時脂質(zhì)體表面修飾配體是構(gòu)建主動靶向脂質(zhì)體的重要方式，能夠使其靶向到特異性組織[15]。

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)是一種天然多糖，是目前研究較多的一種主動靶向配體，透明質(zhì)酸及其衍生物可與細胞表面受體CD44特異性結(jié)合[16]。HA受體在多種惡性腫瘤細胞表面高表達，如肺腺癌、卵巢癌、乳腺癌等[17]，因此表面經(jīng)透明質(zhì)酸及其衍生物修飾的脂質(zhì)體可靶向遞送抗腫瘤藥至HA受體高表達的腫瘤細胞和組織。本研究選取透明質(zhì)酸(HA)為主動靶向的配體修飾載咖啡酸的脂質(zhì)體(HA-CA脂質(zhì)體)，增加CA的抗腫瘤效果，同時達到靶向治療的目的。

1　儀器與材料

1.1　儀器

ALPHA 2-4 LSC凍干機(德國Christ公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海青浦瀘西儀器廠)；Agilent 1100 Series高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；CJ-2S超凈臺(江蘇天潤儀器有限公司)；DM-IL倒置顯微鏡(德國徠卡公司)；TGL-16G-A離心機(上海安亭科學儀器廠)；Forma Series細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；恒溫搖床(北京同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司)；Model 550酶聯(lián)分析儀(美國 BIORAD 公司)；100 μL、1 000 μL移液槍 (美國Thermo Scientific公司)；Thermo Array scan VTI 高內(nèi)涵篩選儀(Thermo Scientific)。

1.2　藥品與試劑

咖啡酸、DOPE、大豆磷脂、膽固醇、MTT、Hochest 33258(美國Sigma公司)；透明質(zhì)酸鈉(Mw=8 000 Da)(山東福瑞達生物化工有限公司)；胎牛血清(FBS，美國GIBCO 公司)；胰酶(美國Hyclone公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；6-香豆素(日本TCI公司8LUEF-CC)；其余試劑為分析純。

人肺腺癌A549細胞(川北醫(yī)學院)；人肝癌HepG2細胞(川北醫(yī)學院)。

2　方法與結(jié)果

2.1　HA-DOPE的制備[18]

稱取HA 30 mg，置10 ml蒸餾水中溶脹后超聲溶解。加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)60 mg和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)90 mg，加氫氧化鈉溶液調(diào)至pH值7.5，于37℃水浴活化24 h。持續(xù)攪拌下滴加含DOPE 72 mg的混懸液，反應過夜。透析除去反應液中多余反應物和副產(chǎn)物，經(jīng)薄層色譜(展開劑：氯仿-甲醇-水，65：25：4，碘蒸氣顯色)驗證,反應液中已無游離DOPE存在，冷凍干燥即得。

2.2　HA-CA脂質(zhì)體的制備

精密稱取卵磷脂120 mg，膽固醇30 mg(磷脂比為4∶1)，咖啡酸5 mg于茄型瓶中，加入氯仿丙酮混合溶劑10 ml(氯仿：丙酮體積比為4∶1)，超聲使其充分溶解，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中將溶劑蒸出。加入3 ml(pH值7.4)PBS磷酸鹽緩沖溶液和2 ml HA-DOPE的PBS溶液(HA-DOPE含量為1 g/L)后在60 ℃水浴條件下水化1 h，即得。

2.3　HA-CA脂質(zhì)體的粒徑測定

取脂質(zhì)體適量，用超純水稀釋后用動態(tài)光散射粒徑分析儀測定粒徑，測得平均粒徑、多分散系數(shù)(PDI)，結(jié)果見圖1。平均粒徑為210.5 nm，PDI為0.17，粒徑分布較窄，脂質(zhì)體粒徑較均勻。

圖1　粒徑分布圖

2.4　咖啡酸體外含量測定方法的建立

2.4.1色譜條件[19]

Agilent C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流動相為甲醇:0.1%磷酸水溶液(15∶85)；檢測波長為327 nm；流速為1.0 mL/min；進樣量為5 μL；柱溫為35℃。

2.4.2標準曲線的繪制

精密稱取咖啡酸原料藥適量，用甲醇溶解，制備成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 g/L的梯度標準溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。在“2.4.1”的色譜條件下測定咖啡酸的峰面積，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線,得咖啡酸的標準曲線方程Y=28 883X-19.506，R2=0.999 4，表明咖啡酸在0.1～0.8 g/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2　咖啡酸標準曲線圖

2.4.3精密度試驗

精密吸取濃度為0.2 g/L的咖啡酸樣品溶液，在“2.4.1”色譜條件下測定，共6次，RSD為1.22%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.4.4穩(wěn)定性試驗

精密吸取濃度為0.2 g/L的咖啡酸樣品溶液進樣測其穩(wěn)定性，每3 h測定1次，共6次，RSD為1.11%(n=6)，表明咖啡酸樣品在15 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表1　精密度和穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.4.5回收率試驗

精密量取濃度為0.4 g/L的咖啡酸樣品溶液適量，按比例加入HA空白脂質(zhì)體1 mL，用流動相配成高、中、低3種質(zhì)量濃度的咖啡酸脂質(zhì)體溶液，每種5份，加甲醇破壞脂質(zhì)體，稀釋定容至刻度，搖勻，離心吸取上清液，在“2.4.1”項色譜條件下測定。結(jié)果回收率分別為98.2%、99.5%、98.6%。

2.5　HA-CA脂質(zhì)體包封率的測定

采取離心法測定脂質(zhì)體的包封率。量取HA-CA脂質(zhì)體溶液2 mL，置于離心管中，14 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心30 min，下層沉淀部分即為制備的咖啡酸脂質(zhì)體。小心倒去含有游離咖啡酸的上層溶液，用甲醇溶液超聲20 min溶解底部的咖啡酸脂質(zhì)體后置5 ml容量瓶中定容，在“2.4.1”的色譜條件下測定咖啡酸的峰面積，代入標準曲線，按外標法計算咖啡酸的含量，并計算HA-CA脂質(zhì)體的包封率。連續(xù)測定5批脂質(zhì)體，得到HA-CA脂質(zhì)體的包封率為(88.87±1.32)%。

包封率公式如下：包封率(CA)=MCA/M×100%，其中MCA為消解后測得CA的濃度，M為制備時加入的CA的量。

2.6　HA-CA脂質(zhì)體的細胞毒性實驗

分別培養(yǎng)A549細胞(HA受體高表達)和HepG2(HA受體低表達)并接種于96孔板中，當孔板中細胞完全貼壁且處于對數(shù)生長期時，以含10%FBS的培養(yǎng)基為空白對照組，以未經(jīng)藥物處理過的細胞懸液為陰性對照組，加入3個濃度(5、15、30 μL/ml)的游離CA、CA脂質(zhì)體以及HA-CA脂質(zhì)體。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后取出，每孔加入MTT 20 μL(20 g/L) 溶液，再放回孵箱中繼續(xù)孵育4 h。離心，棄上清，每孔加入200 μL DMSO，振蕩10 min，用酶標儀在490 nm 處測定各孔的光密度值(OD)。計算空白脂質(zhì)體、游離CA、CA脂質(zhì)體以及HA-CA脂質(zhì)體對A549細胞和HepG2細胞的增殖抑制率。

細胞抑制率=[1-(OD實驗組-OD空白組)/(OD陰性對照組-OD空白組)]×100%

實驗結(jié)果如圖3～4所示，隨著藥物濃度的增加A549細胞和HepG2細胞的增殖抑制率增強。在相同給藥濃度下，HA-CA脂質(zhì)體對A549細胞的增殖抑制作用顯著強于CA脂質(zhì)體，最高達80.11%，而對于HepG2細胞來說，HA-CA脂質(zhì)體的增殖抑制作用與CA脂質(zhì)體相當。

圖3　細胞抑制率圖(A549，48 h)

圖4　細胞抑制率圖(HepG2，48 h)

2.7　細胞攝取實驗

精密稱取6-香豆素0.5 mg于10 ml容量瓶中，加二氯甲烷溶解，配制成0.05 g/L的6-香豆素儲備液。另精密稱取卵磷脂120 mg，膽固醇30 mg(磷脂比為4∶1)，加入氯仿丙酮混合溶劑10 ml(氯仿：丙酮體積比為4∶1)，超聲使其充分溶解，加入1 ml香豆素溶液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中將溶劑蒸出，直至在瓶壁上形成均勻的脂質(zhì)膜。加入3 ml(pH值7.4)PBS磷酸鹽緩沖溶液和2 ml HA-DOPE的PBS溶液(HA-DOPE含量為1 g/L),在60℃水浴條件下水化1 h，即得。

分別將培養(yǎng)24 h的A549細胞和HepG2細胞懸液(密度為10×104個/mL)棄去培養(yǎng)基，將6-香豆素DMSO溶液、HA-C脂質(zhì)體加藥，每孔加入1 mL，繼續(xù)于37℃孵育2 h；棄去培養(yǎng)基，并以冷的PBS洗2次；再以4%多聚甲醛固定10 min；再用冷的PBS洗2次；以Hochest 33258 (2.5 μg/mL)染細胞核15 min后，再以PBS洗1次，最后置于高內(nèi)涵儀中分析結(jié)果。

實驗結(jié)果表明，在HepG2細胞組，6-香豆素和HA-C脂質(zhì)體組的熒光攝取量并未存在明顯差異。在A549細胞組，HA-C脂質(zhì)體的熒光攝取量明顯高于6-香豆素。該種現(xiàn)象提示，HA脂質(zhì)體在HA受體高表達的A549細胞組的細胞攝取明顯大于在HA受體低表達的HepG2細胞，初步證明HA脂質(zhì)體的細胞靶向性。結(jié)果見圖5～6。

圖5　細胞攝取熒光值圖

圖6　細胞攝取圖

3　討論

本文以HA為主動靶向配體，脂質(zhì)體為藥物載體，構(gòu)建了HA-CA脂質(zhì)體，用以改善CA自身理化性質(zhì)的局限，從而達到增強CA抑制腫瘤作用的目的。MTT實驗結(jié)果顯示，與游離CA相比，將CA包載至脂質(zhì)體后的CA脂質(zhì)體可增強其對A549細胞和HepG2的細胞毒性。另外，HA-CA脂質(zhì)體對高表達HA受體的A549的細胞毒性顯著大于CA脂質(zhì)體，而對于低表達HA受體的HepG2細胞而言，HA-CA脂質(zhì)體與CA脂質(zhì)體的細胞毒性作用相當，說明HA-CA脂質(zhì)體由于HA主動靶向配體的加入，使其能主動靶向至HA受體高表達細胞，增強藥物對細胞的毒性作用。細胞攝取實驗同樣證明，HA-CA能夠增強HA受體高表達細胞A549的細胞攝取率，從而提高藥效。關(guān)于HA-CA脂質(zhì)體的主動靶向通路以及其體內(nèi)抑制腫瘤能力等還有待進一步研究。