谷虹霏，戴小華，阿依姑麗·艾合麥提，賈楠楠，張少鵬，楊若藍(lán)

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆　烏魯木齊　830052)

野山杏具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和廣泛的藥理學(xué)功效，含有多種黃酮類化合物，這是近年來被廣為關(guān)注的天然產(chǎn)物之一。大量研究表明，黃酮類化合物具有抗氧化[1]、降血脂[2]、抗炎[3]、鎮(zhèn)痛[4]、保肝[5]和抗腫瘤[6]等多種藥理作用。黃酮類化合物與化學(xué)合成藥物相比毒性較小，與嗎啡和阿司匹林的作用機(jī)制不同，是一類新型的鎮(zhèn)痛藥物[7]。有研究表明,小葉榕葉總黃酮[8]也具有良好的鎮(zhèn)痛作用，對(duì)緩解疼痛疾病的治療具有重要意義。

本研究在張華[9]和劉江波[10]的研究基礎(chǔ)上以新疆野山杏為材料，采用有機(jī)溶劑超聲提取法及大孔吸附樹脂純化法，純化新疆野山杏總黃酮；通過建立小鼠疼痛模型[11-12]，對(duì)新疆野山杏總黃酮的鎮(zhèn)痛作用進(jìn)行考察，為進(jìn)一步開發(fā)新疆野山杏的藥用價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料及試劑

野山杏果肉(采自新疆哈密伊吾縣)；蘆丁標(biāo)品(上海源葉生物科技有限公司)；醋酸(遼寧東寧藥業(yè)有限公司)；阿司匹林(BJ-27466，拜耳醫(yī)藥保健有限公司)；生理鹽水(石家莊四藥有限公司)；無水乙醇、甲醇、亞硝酸鈉、硝酸銀、氫氧化鈉(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)。

昆明種小鼠由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SYXK-新2003-0001。

1.2　設(shè)備與儀器

超聲波藥品處理機(jī)(JBT/C-YCL400T/3P(D,濟(jì)寧金百特工程機(jī)械有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52B，上海亞榮化儀器廠)；可見分光光度計(jì)(723，上海欣茂儀器有限公司)；循環(huán)水多用真空泵(SHB-Ⅲ，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-S，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9246A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；電子天平(SL202N，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；智能熱板儀(RB-200，成都泰盟科技有限公司)。

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣品制備

張均、張垍為唐朝玄宗時(shí)期的宰相張說之子，頗受唐玄宗器重，分別在朝中擔(dān)任過重要官職。張均為張說長(zhǎng)子，曾任大理寺卿一職；張垍為張說次子，為當(dāng)朝駙馬。二人在安史之亂中投靠于安祿山，并分別在其軍中擔(dān)任偽中書令、宰相之職。安史之亂被平定之后，二人結(jié)局或死或發(fā)配。但究竟孰死孰生，《資治通鑒》記載與《舊唐書》《新唐書》《冊(cè)府元龜》記載并不相同。

取一定量的野山杏果實(shí)干燥、粉碎，過40目篩，加50倍量體積分?jǐn)?shù) 50%乙醇超聲1 h，提取2次，抽濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，大孔樹脂純化干燥后得野山杏總黃酮。用生理鹽水將野山杏總黃酮配制為所需的濃度，4℃保存?zhèn)溆肹1]。

1.3.2動(dòng)物準(zhǔn)備

昆明種小鼠100只，體質(zhì)量(21±2)g，雌雄各50只。實(shí)驗(yàn)前小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，挑選飲水、進(jìn)食以及活動(dòng)正常的小鼠納入實(shí)驗(yàn)。

1.3.3野山杏總黃酮的含量測(cè)定

1.3.3.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.00 mg于棕色容量瓶中，用60%乙醇溶液定容至100 mL，搖勻，得到濃度為0.20 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00，7.00，8.00，9.00 mL，分別置于25 mL 棕色容量瓶中，分別滴加50 g/L亞硝酸鈉溶液0.7 mL，混勻，靜置6 min，再分別滴加100 g/L硝酸鋁溶液0.7 mL，混勻，靜置6 min，再加40 g/L氫氧化鈉溶液5 mL，最后用甲醇定容至25 mL，搖勻，放置10 min。取配制好的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，在UV2550紫外分光光度計(jì)510 nm處測(cè)定吸光度，以吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)、蘆丁濃度C為橫坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線[1]。

1.3.3.2含量測(cè)定

稱取“1.3.1”制備的樣品20.0 mg，用60%乙醇溶液溶解并定容至100 mL容量瓶中。吸取2 ml配制好的樣品溶液于25 mL棕色容量瓶中，按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法分別滴加50 g/L亞硝酸鈉溶液0.7 mL、40 g/L氫氧化鈉溶液5 mL、100 g/L硝酸鋁溶液0.7 mL，最后用60%乙醇定容至刻度線，搖勻。在510 nm處測(cè)定野山杏總黃酮的吸光度，每組平行測(cè)3次，根據(jù)吸光度并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到總黃酮含量[1]。

1.3.4小鼠醋酸扭體實(shí)驗(yàn)

取50只雌雄各半的昆明種小鼠，按每組10只隨機(jī)分為高劑量組(15 mg/kg)、中劑量組(11 mg/kg)、低劑量組(7.5 mg/kg)、陽性對(duì)照組(阿司匹林10 mg/kg)、空白對(duì)照組(生理鹽水)。野山杏總黃酮、阿司匹林和生理鹽水為小鼠灌胃給藥，每日給藥1次，連續(xù)3天，第3天給藥前12 h禁食，不禁水。第3天給藥30 min后，以1%醋酸溶液0.2 ml 皮下注射，30 min后記錄小鼠10 mim內(nèi)扭體次數(shù)，以此作為痛閾指標(biāo)[11]。藥物對(duì)扭體反應(yīng)的抑制率為：

1.3.5小鼠熱板致痛實(shí)驗(yàn)

取50只雌性昆明種小鼠，按每組10只隨機(jī)分為高劑量組(15 mg/kg)、中劑量組(11 mg/kg)、低劑量組(7.5 mg/kg)、陽性對(duì)照組(阿司匹林10 mg/kg)、空白對(duì)照組(生理鹽水)。將小鼠放置在恒溫55℃的熱板上，以小鼠出現(xiàn)舔足反應(yīng)的時(shí)間作為痛閾指標(biāo)，其中舔足反應(yīng)為熱刺激小鼠足部產(chǎn)生疼痛的反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)前篩選痛閾5～30 s者為合格實(shí)驗(yàn)鼠，給藥前測(cè)定小鼠舔足反應(yīng)時(shí)間2次，2次測(cè)量間隔5 min，取其平均值作為基礎(chǔ)痛閾。野山杏總黃酮、阿司匹林和生理鹽水為小鼠灌胃給藥，每日給藥1次，連續(xù)3天，第3天給藥后10、30、60 min測(cè)定痛閾指標(biāo)[12]。

1.3.6小鼠溫浴甩尾實(shí)驗(yàn)

取50只雌雄各半的昆明種小鼠，按每組10只隨機(jī)分為高劑量組(15 mg/kg)、中劑量組(11 mg/kg)、低劑量組(7.5 mg/kg)、陽性對(duì)照組(阿司匹林10 mg/kg)、空白對(duì)照組(生理鹽水)。將小鼠尾尖浸入48℃恒溫水中約5 cm，以小鼠出現(xiàn)甩尾反應(yīng)的時(shí)間作為痛閾指標(biāo)，其中甩尾反應(yīng)指熱刺激小鼠尾部產(chǎn)生疼痛的反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)前預(yù)選痛閾5～30 s者為合格實(shí)驗(yàn)鼠，給藥前測(cè)小鼠舔足反應(yīng)時(shí)間2次，2次測(cè)量間隔5 min，取其平均值作為基礎(chǔ)痛閾。野山杏總黃酮、阿司匹林或生理鹽水為小鼠灌胃給藥，每日給藥1次，連續(xù)3天，第3天給藥2 h后測(cè)定每只小鼠熱板致痛實(shí)驗(yàn)的痛閾指標(biāo)[11]。

1.4　數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)分析用SPSS19.0進(jìn)行分析，采用單因素方差分析。

2　結(jié)果

2.1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：A=11.162C+0.012 2(R2=0.999)，說明在0.016～0.072 mg/mL的范圍內(nèi)蘆丁質(zhì)量濃度C與吸光度A之間有良好的線性關(guān)系。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2　野山杏總黃酮的含量

在UV2550紫外分光光度計(jì)510 nm處測(cè)定野山杏總黃酮的吸光度，每組平行3次測(cè)定，取平均值。根據(jù)測(cè)定的吸光度值結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得出總黃酮含量為817 mg/mL。

2.3　野山杏總黃酮對(duì)小鼠醋酸扭體反應(yīng)的影響

各劑量組對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的抑制情況見表1。與空白對(duì)照組比較，野山杏總黃酮低、中、高劑量組和陽性對(duì)照組均具有極顯著性差異(P<0.01)，其中野山杏總黃酮低、中、高劑量組疼痛抑制率分別為16.57%、26.12%、51.68%。結(jié)果表明,野山杏總黃酮低、中、高劑量組和陽性對(duì)照組均能明顯減少醋酸致痛模型中小鼠扭體次數(shù)，具有一定的劑量依賴性，隨著劑量增大，抑制疼痛作用越強(qiáng)。

表1　不同劑量野山杏總黃酮對(duì)醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響

注：與空白對(duì)照組比較，**P<0.01

2.4　野山杏總黃酮對(duì)小鼠熱板舔足反應(yīng)的影響

如表2所示，與空白對(duì)照組比較，野山杏總黃酮高、中、低劑量組均可明顯延長(zhǎng)小鼠舔足反應(yīng)時(shí)間，抑制小鼠的疼痛舔足反應(yīng)，具有明顯鎮(zhèn)痛作用。其中，野山杏總黃酮的高、中劑量組在60 min內(nèi)均具有明顯延長(zhǎng)熱板法致痛模型中小鼠痛閾的作用(P<0.01)。

表2　不同劑量野山杏總黃酮對(duì)熱板致小鼠舔足反應(yīng)的影響

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.5　野山杏總黃酮對(duì)小鼠溫浴甩尾反應(yīng)的影響

如表3所示,野山杏總黃酮野山杏總黃酮低、中、高劑量組和陽性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比,均明顯延長(zhǎng)小鼠甩尾反應(yīng)時(shí)間(P<0.01)。野山杏總黃酮的低劑量對(duì)熱板致痛的小鼠痛閾具有一定的抑制作用，野山杏總黃酮的高劑量可明顯延長(zhǎng)溫浴致痛模型中小鼠的痛閾(P<0.01)，具有顯著的鎮(zhèn)痛作用。

表3　不同劑量野山杏總黃酮對(duì)溫浴致小鼠甩尾反應(yīng)的影響

注：與空白對(duì)照組比較，**P<0.01

3　討論

野山杏總黃酮是從野山杏果肉中提取的有效成分,且總黃酮大多具有抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用。張蓓蓓等[7]研究表明，滁菊總黃酮的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制可能與促進(jìn)血清和腦組織中NO的釋放，抑制其前列腺素E2的生成有關(guān)，其中可能有部分中樞機(jī)制參與。因此本實(shí)驗(yàn)采用熱板致痛法、溫浴致痛法和扭體致痛法3種不同類型經(jīng)典小鼠疼痛模型[11-12]，觀察新疆野山杏總黃酮的鎮(zhèn)痛作用。其中，熱板致痛法、溫浴致痛法屬于熱刺激，代表的是小鼠軀體體表痛，而醋酸致痛法則屬于化學(xué)刺激，代表的是小鼠體內(nèi)內(nèi)臟痛。熱板致痛法、溫浴致痛法引起的是急性疼痛，而醋酸致痛法引起的是緊張性的病理性疼痛[13-14]。熱板致痛法和溫浴致痛法主要利用小鼠足趾和尾部對(duì)熱刺激十分敏感的特點(diǎn)，小鼠主要表現(xiàn)為舔足，甩尾，縮尾等反應(yīng)；醋酸致痛法將醋酸注入小鼠腹腔，引起腹膜炎，誘導(dǎo)產(chǎn)生病理性疼痛，以此來考察新疆野山杏總黃酮的鎮(zhèn)痛作用。

在本實(shí)驗(yàn)中，野山杏總黃酮高、中、低劑量組均對(duì)醋酸致小鼠疼痛扭體反應(yīng)有明顯的抑制作用。這與余行等[15]研究中大葉紫珠總黃酮高、中、低劑量組均具有明顯鎮(zhèn)痛作用的研究結(jié)果一致。野山杏總黃酮高、中、低劑量組均可顯著延長(zhǎng)熱板致小鼠疼痛舔足反應(yīng)時(shí)間，具有明顯提高小鼠舔足反應(yīng)痛閾的作用。這與俸婷婷等[16]研究桑白皮總黃酮對(duì)熱板致小鼠疼痛舔足反應(yīng)無明顯抑制作用的結(jié)論不一致。溫浴致小鼠疼痛實(shí)驗(yàn)中，野山杏總黃酮高、中、低劑量組能明顯提高小鼠甩尾反應(yīng)痛域，特別是高劑量組作用明顯。通過3種不同類型經(jīng)典小鼠疼痛模型實(shí)驗(yàn)觀察得出新疆野山杏總黃酮可明顯抑制小鼠疼痛反應(yīng)，隨著劑量的增加，抑制作用越明顯，痛閾相應(yīng)提高，具有一定的劑量依賴性。野山杏總黃酮具有明顯得鎮(zhèn)痛作用，因此可以認(rèn)為野山杏鎮(zhèn)痛作用的有效成分是總黃酮，但具體的黃酮成分有待進(jìn)一步研究。

由于熱板法、溫浴法同是熱刺激的急性疼痛模型，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)過程中，采用熱板致痛小鼠疼痛模型觀察小鼠給藥后10 min，30 min，60 min后疼痛反應(yīng)的痛閾提高率。溫浴致痛小鼠疼痛模型觀察給藥2 h后疼痛反應(yīng)的痛閾提高率。通過2種熱刺激疼痛模型觀察不同時(shí)間范圍內(nèi)野山杏總黃酮對(duì)小鼠疼痛反應(yīng)時(shí)間和痛閾提高率的影響，由表2分析可知，在給藥2 h后，熱刺激致小鼠疼痛反應(yīng)痛域呈先增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì)，在30 min到60 min范圍達(dá)到峰值。在熱板致痛實(shí)驗(yàn)中，隨著時(shí)間的增加，在給藥10 min～30 min內(nèi)，野山杏總黃酮高、中、低劑量組對(duì)小鼠舔足反應(yīng)痛域提高幅度較大，30 min～60 min內(nèi)，痛域提高幅度較小。然而本研究中新疆野山杏總黃酮純化后純度較高，鎮(zhèn)痛作用顯著，小鼠疼痛模型實(shí)驗(yàn)中對(duì)小鼠灌胃新疆野山杏總黃酮藥劑量設(shè)置有限，其最佳藥效劑量和最佳藥效作用時(shí)間還有待進(jìn)一步研究確定。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)考察了新疆野山杏總黃酮的鎮(zhèn)痛作用，結(jié)果顯示野山杏總黃酮具有顯著的鎮(zhèn)痛作用。但是在最佳藥效作用時(shí)間和劑量以及其主要作用成分，還有待進(jìn)一步研究。本研究為新疆本土特色資源開發(fā)利用提供研究基礎(chǔ)，具有十分重要的意義。