張慧，何帥兵，孔繁德，陳海梅，唐泰山，徐淑菲，苗麗，劉昶*

(1.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院，藥用植物研究所，北京　100193；2.廈門出入境檢驗檢疫局技術中心，廈門　361026；3.江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇　南京　210001；4.河南出入境檢驗檢疫局，河南　鄭州　450003)

益母草(Leonurusartemisia(Lour.)S.Y.Hu)為唇形科(Lamiaceae)益母草屬1年或2年生草本植物，具有活血化瘀、調經利水的功能[1]。作為臨床常用中藥，益母草素有“婦科要藥”之稱?，F代研究表明,益母草不僅在婦科疾病治療方面發(fā)揮著重要作用，而且對包括心血管疾病、免疫系統(tǒng)疾病在內的多種其他疾病也都有很好的治療效果[2]?？梢哉f益母草不僅具有重要的藥用價值，同時也具有良好的社會效益。

益母草屬植物全球分布23種，我國有12種和2個變種，廣泛分布于全國各地[3]。在實際應用中，益母草屬不同物種之間存在混用、誤用的現象。而物種的分類與精準鑒定能夠有效避免這一現象的發(fā)生，對保障臨床用藥的有效性具有重要意義。近年來，隨著基因測序技術的快速發(fā)展，越來越多植物的葉綠體基因組信息得以解析。目前，基于葉綠體基因組的植物精準鑒定和系統(tǒng)發(fā)育學研究得到了越來越多研究者的青睞，被認為是植物鑒定與系統(tǒng)發(fā)育關系研究的一種有效手段。自1986年首個植物葉綠體基因組——煙草葉綠體基因組測序完成，研究者對植物葉綠體基因組的關注逐漸升溫[4]。截至目前，GenBank數據庫已經收錄了包括陸地植物，海洋植物在內的2 470種植物的葉綠體基因組信息。然而，益母草屬植物葉綠體基因組信息尚且無人提供，這在一定程度上阻礙了該屬植物的精準鑒定。本研究以益母草為研究對象，通過對其葉綠體基因組的組裝和分析，探討益母草葉綠體基因組的結構信息，旨在為益母草種質資源的開發(fā)和利用提供科學依據，同時也為今后益母草屬植物的系統(tǒng)進化關系和植物分類學研究提供具有參考意義的線索。

1　材料與方法

1.1　DNA提取和建庫測序

益母草新鮮葉片采自中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所藥用植物園。經中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所張昭研究員鑒定為益母草(Leonurusartemisia(Lour.)S.Y.Hu)。利用植物DNA提取試劑盒(TIANGEN，北京)提取益母草新鮮葉片總DNA。利用瓊脂糖凝膠，NanoDrop2000微量分光光度計(Thermo Scientific，美國)和Qubit 3.0檢測總DNA的濃度和質量，各項檢測指標滿足測序要求后，最終交由測序公司完成測序。采用Illumina Miseq PE300雙末端測序策略進行建庫測序，測序所得數據量為5.8 G。

1.2　葉綠體基因組組裝與注釋

首先，以GenBank數據庫下載的的1 688條葉綠體基因組作為參考序列。利用BLASTN程序，設置閾值E-value為1e-5篩選出與參考序列相似的reads，并用SPAdes (v3.10.1)軟件進行組裝。然后使用Python腳本對第一輪組裝結果進行延伸，從而完成完整葉綠體基因組序列的組裝。為了驗證序列組裝的正確性，應用Bowtie 2(v2.0.1)13軟件將原始reads映射(mapping)到益母草葉綠體基因組序列上來檢測葉綠體基因組序列覆蓋度和各contig連接處的正確性。最后，通過Cpgavas軟件實現葉綠體基因組的自動注釋，并通過Apollo軟件手工調整、校正基因邊界位置[5-6]。在完成益母草葉綠體基因組的注釋與校正之后，利用sequin軟件提交益母草葉綠體基因組數據至GeneBank數據庫(注冊號:MG673937)。最終，基于OrganellarGenomeDRAW軟件實現益母草葉綠體基因組的可視化[7]。

1.3　葉綠體基因組序列特征分析

利用TRF 4.04(http://tandem.bu.edu/trf/trf.html)軟件預測串聯(lián)重復序列，參數采用軟件默認參數；基于MISA軟件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)檢測葉綠體基因組簡單重復序列(simple sequence repeats, SSR)，參數設置為：1)1-8、2-4、3-4、4-3、5-3和6-3，即1個堿基重復≥8次、2/3個堿基重復≥4次、4/5/6個堿基重復≥3次；2)2個SSR之間的最小距離設置為100 bp，若距離小于100 bp，則2個SSRs序列組成一個復合微衛(wèi)星。最終，利用EMBOSS軟件包中的的Cusp和Compseq程序分析益母草葉綠體基因組密碼子相對使用度和GC含量分布情況。

1.4　系統(tǒng)進化分析

為了確定益母草的系統(tǒng)發(fā)育關系，本研究基于APG IV系統(tǒng)選擇了17種被子植物的完整葉綠體基因組序列，以煙草和擬南芥為外類群，利用65個共有蛋白序列構建最大似然(maximum-likelihood, ML)系統(tǒng)發(fā)育樹。通過ClustalW軟件完成多重序列比對[8]，利用Raxmal軟件構建ML系統(tǒng)進化樹。參數設置如下：“raxmlHPC-PTHREADS-SSE3 -f a -N 1000 -m PROTGAMMACPREV/GTRGAMMA -x 551314260 -p 551314260 -o Buxus_microphylla, Pachysandra_terminalis -T 20”。

2　結果與分析

2.1　益母草葉綠體基因組序列特征

益母草葉綠體基因組為典型的的環(huán)狀雙鏈分子?？傞L度為151 610 bp，呈典型的四分狀結構，包括一對反向重復區(qū)(inverted repeat,IR)、一個大單拷貝區(qū)(large single copy region,LSC)和一個小單拷貝區(qū)(small single copy region,SSC)，其長度分別為25 634 bp、82 827 bp和17 515 bp。益母草葉綠體基因組的整體GC含量為38.41%，低于IR區(qū)的GC含量(43.37%)但高于SSC區(qū)(32.23%)和LSC區(qū)(36.65%)，這主要是由于IR區(qū)存在4個高GC含量的rRNA基因造成的[9]。蛋白編碼序列包含了27 013種密碼子，其中使用頻率最高的為亮氨酸密碼子，使用頻率高達2 894(10.71%)次。與之相反，半胱氨酸密碼子的使用頻率最低，其使用頻率為310次(1.15%)。密碼子的第一位，第二位和第三位的A/T含量分別為59.71%、60.66%、和62.69%。與其他大多數陸地植物中觀察到的現象相一致，密碼子第三位的A/T含量偏高[10]。

表1　益母草葉綠體基因組堿基組成

圖1　益母草葉綠體基因組環(huán)形基因圖注:內側基因順時針轉錄；外側基因逆時針轉錄；不同功能的基因以不同顏色表示

2.2　益母草葉綠體基因組中的基因歸類

益母草葉綠體基因組共編碼基因134個，去除重復基因后共有115個基因。其中83個基因編碼蛋白，28個基因編碼tRNAs，4個基因編碼rRNAs。位于IR區(qū)的基因包括7個(rpl2, rpl23, ycf2, ycf15, ndhB, rps7, rps12)蛋白編碼基因、7個tRNA基因和所有的4個rRNA基因。益母草葉綠體基因組中共有20個基因含有內含子，包括13個蛋白編碼基因和7個tRNA基因。其中，clpP和ycf3基因分別含有2個內含子。此外，在益母草葉綠體基因組中，蛋白編碼序列、tRNAs序列和rRNAs序列分別占整個基因組序列長度的53.65%、6.84%和6.19%。而其他33.32%的序列，為包括內含子、基因間區(qū)和假基因在內的非編碼序列。

表2　益母草葉綠體基因組編碼的基因

注：括號中的數字代表基因重復的次數，CDS代表編碼序列

表3　益母草基因組中包含內含子基因及內含子、外顯子長度

注：括號中數字代表基因重復的次數

2.3　益母草葉綠體基因組重復序列分析

在益母草葉綠體基因組中共預測到49個串聯(lián)重復序列(tandem repeat sequences),包括19個正向重復、24個回文重復、5個反向重復和一個互補重復。串聯(lián)重復序列長度均在18～41 bp之間，占葉綠體基因組序列的0.77%。在49個重復序列中，33個分布在基因間區(qū)，14個位于基因編碼區(qū)，另外2個在內含子區(qū)。此外，益母草葉綠體基因組中共含有166個簡單重復序列(SSR)，包括122個單核苷酸重復，35個雙核苷酸重復，3個三核苷酸重復和6個四核苷酸重復。在單核苷酸重復中，約96% (117)的重復是由T/A堿基重復組成的。該研究結果與既往文獻報道的SSRs通常由polyA或者polyT重復組成而很少包含G或C重復是一致的[11]。同時，研究結果也表明SSRs在益母草葉綠體基因組上的分布是不均勻的，LSC區(qū)段含有110個SSRs，而SSC區(qū)段和IR區(qū)段分別僅有30個和26個SSRs。該研究得到的重復序列將為分子標記開發(fā)和種群進化研究提供具有參考意義的線索。

表4　益母草葉綠體基因組中的重復序列

續(xù)表4

注：P：回文重復，F：正向重復，R：反向重復。IGS：基因間區(qū)，CDS：RNA或蛋白編碼序列

表5　不同類型SSR在益母草葉綠體基因組中的出現次數

2.4　益母草葉綠體基因組系統(tǒng)發(fā)育分析

葉綠體基因組數據為植物進化、分類和系統(tǒng)發(fā)育研究提供了豐富的數據基礎。在過去的幾十年里，完整的葉綠體基因組及其蛋白編碼基因已經被用于揭示任何分類級別系統(tǒng)進化關系[12]。在本研究中，筆者為了確定益母草在野芝麻亞科中的進化位置，利用15個野芝麻亞科和2個外類群物種的65個共有蛋白序列構建ML系統(tǒng)進化樹。結果表明，益母草和水蘇屬的親緣關系較近，在所有15個節(jié)點中有11個支持率為100%。進化樹的高支持率表明葉綠體基因組可以有效的解決該科的系統(tǒng)進化關系。

圖2　利用17個物種的65個共有蛋白序列構建的分子進化樹

3　結論

本研究基于二代測序技術首次獲得了益母草屬第一個完整的葉綠體基因組。并在此基礎上，對益母草葉綠體基因組的結構進行了系統(tǒng)的分析。最終基于既往文獻報道的14種野芝麻亞科植物的葉綠體基因組信息探討了益母草的系統(tǒng)發(fā)育關系。研究結果表明，益母草葉綠體基因組的結構和基因組成具有高度的保守性，不存在類似豆科、桔?？频瓤茖買R區(qū)缺失、收縮或擴張的現象[13-14]。通過系統(tǒng)發(fā)育關系分析，本研究確定了益母草在野芝麻亞科中的系統(tǒng)進化位置，結果表明益母草屬與水蘇屬進化關系比較近。益母草作為臨床常用中藥，具有重要的藥用和經濟價值。通過對其葉綠體基因組的測序和分析，不僅為益母草屬進化關系和物種鑒定提供數據基礎，同時也為唇形科系統(tǒng)進化關系和植物分類學研究提供了重要的參考信息。