田麗月，楊璐媛，吳龍月，張麗坤，張鑫，縢悅秋，剛宏林,3，楊東光*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江　哈爾濱　150040；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心血液實驗室，黑龍江　哈爾濱　150001；3.哈爾濱食品藥品檢驗檢測中心，黑龍江　哈爾濱　150025)

CML是一種起源于造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell,HSC)水平的惡性克隆性疾病，以存在t(9;22)易位的費城染色體為特征，其融合基因的蛋白產(chǎn)物Bcr-Abl具有持續(xù)增高蛋白酪氨酸激酶活性，被認(rèn)為是CML的致病性蛋白[1]。CML多表現(xiàn)為乏力、消瘦、發(fā)熱、自汗或盜汗、腹痛、脾腫大、肝腫大、淋巴結(jié)腫大等[2-5]。根據(jù)其臨床表現(xiàn)，中醫(yī)學(xué)多將本病歸為“虛勞”“癥瘕”“積聚”“血證”等范疇,并認(rèn)為，本病的發(fā)生多因“虛”“毒”“瘀”所致[6]。王運津等[7]將慢粒辨證分為肝熱血瘀型、熱毒熾盛型和正虛邪實型，慢性期多為肝熱血瘀型，治宜清肝化瘀為主；加速期和急變期多為熱毒熾盛型和正虛邪實型，治以清肝化瘀，益氣養(yǎng)陰，宜清肝化瘀為主[8]。

以伊馬替尼(Imatinib mesylate, IM)為代表的蛋白酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)針對CML的致病蛋白Bcr-Abl設(shè)計，是目前CML的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。但發(fā)生IM耐藥的CML患者病情進展迅速、預(yù)后不良，IM耐藥因此成為CML治療的瓶頸和亟待解決的問題。

近年來研究認(rèn)為，耐藥的關(guān)鍵是CML干細(xì)胞(Leukemia stem cells,LSCs)對IM治療不敏感，產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因是Bcr-Abl并非CML-LSCs賴以生存的唯一通路，在IM作用下，CML-LSCs可以依靠其他通路提供的生存信號得以存活。自我更新能力和白血病形成能力是LSCs的主要功能，研究證實，Hh通路是影響CML-LSCs自我更新能力和白血病形成能力的重要通路。Hh通路的活化起始于細(xì)胞外配體Hh，該肽與細(xì)胞膜受體Ptch的結(jié)合解除了Ptch對Smo的抑制作用，因此,Smo可以將其信號傳遞給進入初級鞭毛的Gli2，Gli2進入細(xì)胞核，活化Gli1及其下游的靶基因Ptch和CyclinD1。Gli1是負(fù)責(zé)全面活化Hh通路的基因，并通過Ptch以負(fù)反饋的形式調(diào)控Hh信號通路的范圍和強度[9]。因此，Gli1和Gli2是執(zhí)行Hh信號的關(guān)鍵蛋白。

亞砷酸(Arsenic trioxide, ATO)在2010年被認(rèn)定為Hh通路的靶向性抑制劑，這為ATO應(yīng)用于CML的IM耐藥治療提供了理論上的可能性。但ATO對CML-LSCs及其Hh通路的抑制作用及抑制機制尚未闡明。本課題組率先在應(yīng)用ATO治療并獲得滿意療效的APL患者上進行了ATO對Hh通路抑制作用的驗證。但ATO對Hh通路重要分子表達的影響尚有待證實。

本研究以CML細(xì)胞株K562為模型，初步探討ATO對CML細(xì)胞Hh通路關(guān)鍵分子抑制作用及機制，為該藥應(yīng)用于CML的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料

人類CML細(xì)胞株K562(本實驗室長期培養(yǎng))；ATO注射液(10 mg/10 mL，哈爾濱伊達藥業(yè))；TRIzol(invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PROMEGA公司)；Fast Start Universal SYBR Green PCR Master實時定量PCR試劑盒(羅氏公司)；RIPA強裂解液(碧云天公司)；抗c-Abl抗體(sc-56887，Santa Cruz公司)；堿磷顯色二抗(Amersham公司)。

1.2　方法

1.2.1人類CML細(xì)胞株K562培養(yǎng)與處理

K562細(xì)胞使用含10%胎牛血清(杭州四季青)和濃度為100 IU/M青鏈霉素(Invitrogen)的1640培養(yǎng)基中(Gibco)，置于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中長期培養(yǎng)。實驗時，使用不同濃度的ATO溶液連續(xù)作用于K562細(xì)胞48 h，并收集細(xì)胞，做下一步檢測。

1.2.2實時定量PCR

收集經(jīng)過濃度分別為0、0.5、1、2 μM ATO處理的K562細(xì)胞，采用TRIzol分別對細(xì)胞株的總RNA進行抽提，然后逆轉(zhuǎn)mRNA至cDNA。應(yīng)用primer Express2.0軟件 (ABI公司)設(shè)計qRT-PCR引物，并交由上海生工合成。引物序列見表1。

應(yīng)用Fast Start Universal SYBR Green PCR Master試劑盒，依據(jù)生工提供的退火溫度設(shè)定反應(yīng)條件，進行目的基因擴增。所有對目的基因的檢測，均重復(fù)3次，取平均值。使用2-△△CT計算處理前后基因變化的比值。

1.2.3免疫印跡

收集經(jīng)過濃度分別為0、1、2、4 μM ATO處理的K562細(xì)胞，采用RIPA強裂解液提取蛋白后進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，用蛋白轉(zhuǎn)移裝置將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，按轉(zhuǎn)移蛋白的常規(guī)方法進行。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，進行免疫印跡、堿磷顯色及灰度分析。采用抗體為抗c-Abl 抗體及堿磷顯色二抗成像。

1.2.4統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1　ATO對CML細(xì)胞Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子基因水平的影響

經(jīng)不同濃度ATO連續(xù)作用于K562細(xì)胞株48 h后，我們對標(biāo)本的目的基因進行了有效擴增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ATO 對Hh通路的核心轉(zhuǎn)錄因子Gli1和Gli2 mRNA的表達具有顯著的抑制作用，其抑制作用呈劑量依賴性(P<0.05)(Fig.1)。ATO可以上調(diào)Hh通路抑制因子ptchmRNA的表達(P<0.05)。但Smo mRNA的表達在各濃度ATO的作用下均未受到影響。

2.2　ATO對CML細(xì)胞P210/Bcr-Abl蛋白表達的影響

經(jīng)不同濃度ATO連續(xù)作用于K562細(xì)胞株48h后，我們檢測了K562細(xì)胞P210/Bcr-Abl蛋白的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ATO對P210/Bcr-Abl蛋白表達具有顯著的抑制作用，其抑制作用呈劑量依賴性(P<0.05)(Fig.2)。

Fig.1　The expression of Gil1, Gli2, Ptch and Smo mRNA in K562 cells cultured under ATO in different concentrations for 48 hours

Fig.2　The expression of P210/Bcr-Abl in K562 cells cultured under ATO in different concentrations for 48 hours

3　討論

砒霜又名白砒，為傳統(tǒng)的以毒攻毒中藥，《本草綱目》記載：“砒乃大熱大毒之藥，而砒霜之毒尤劇”。其藥性峻猛辛，大熱，有大毒，歸肺肝經(jīng)，具有祛痰止哮、截瘧、蝕腐、殺蟲等作用，用于治療寒痰哮喘、瘧疾、休息痢、梅毒、痔瘡、瘰疬、走馬牙疳、癬瘡、潰瘍腐肉不脫等[10]。而經(jīng)中藥砒霜提取制成的靜脈制劑，稱為三氧化二砷(As2O3)或亞砷酸。目前該藥已廣泛應(yīng)用于臨床,治療多種惡性血液病，如白血病、骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征等，并得到全世界的公認(rèn)[11]。

ATO治療CML歷史悠久，最早的抗CML藥物。ATO對CML的作用機理集中在幾個方面：一是ATO能夠活化CML細(xì)胞內(nèi)的自噬通路，直接降解Bcr-Abl蛋白[12]；二是ATO可以誘導(dǎo)CML細(xì)胞發(fā)生凋亡，可以顯著增強IM誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡效應(yīng)，且與IM無交叉耐藥現(xiàn)象[13-14]。三是低濃度的ATO可以殺傷靜止期的CML-LICs，其與阿糖胞苷或α-干擾素(Interferon alpha,IFN)聯(lián)合應(yīng)用，對CML-LICs的克隆形成能力和白血病形成能力都具有很好的抑制效果[15-16]?？梢姡珹TO對CML-LICs的早幼粒細(xì)胞白血病蛋白(promyelocytic leukaemia protein,PML)具有抑制作用。

在近年的研究中，Hh通路在CML發(fā)生耐藥過程中的重要作用逐漸被證實。研究發(fā)現(xiàn)，Hh通路是影響CML-LSCs自我更新能力和白血病形成能力的重要通路。體外實驗中，Smo抑制劑能夠顯著降低CML患者的骨髓細(xì)胞長期培養(yǎng)起始細(xì)胞(Long term culture-initiating cell,LTC-IC)克隆數(shù)，證實了Hh通路對CML-LSCs自我更新能力的重要作用。在體內(nèi)實驗中，采用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的CML鼠模型，發(fā)現(xiàn)Smo的缺失和應(yīng)用其抑制劑可以降低CML鼠的白血病發(fā)病率和二次移植發(fā)病率、延長其發(fā)病潛伏期；Smo過度表達則促進LSCs增殖和CML疾病進展，進一步證實了Hh通路對CML-LSCs白血病形成能力的影響[17]。不僅如此，Hh信號對CML的重要作用還體現(xiàn)在其是CML患者臨床分期和影響IM治療效果的重要標(biāo)志。研究發(fā)現(xiàn)，Shh、Smo和Gli1等Hh通路分子不僅在CML患者中呈高表達，且在BP期的表達量顯著高于CP期[18]。此外，Hh通路的負(fù)反饋調(diào)控因子Ptch低表達是CML患者預(yù)后不良的標(biāo)志，Ptch是預(yù)測IM治療失敗的敏感和特異性指標(biāo)[19]。

值得注意的是，Hh通路靶向抑制劑在體外實驗中的良好療效與其直接應(yīng)用于CML患者尚有很大距離。目前新研發(fā)的小分子藥物，均為針對Hh通路分子Smo的，但需要進行臨床前研究以評價其安全性后才能走向臨床[20]。其次，在髓母細(xì)胞瘤等疾病中發(fā)現(xiàn)，Smo抑制劑的應(yīng)用可導(dǎo)致患者對該療法耐藥[21]。此外，Smo下游分子Gli2和cyclin D1的直接活化，可以繞過Smo抑制劑的作用靶點，是Smo抑制劑耐藥的另外一個原因[22]。所以，由于缺乏臨床應(yīng)用經(jīng)驗,目前Hh通路抑制劑尚無法在CML患者中廣泛應(yīng)用。

2010年有學(xué)者發(fā)現(xiàn),ATO對Hh通路具有靶向性抑制作用，陸續(xù)有研究者通過體內(nèi)外實驗證實，ATO通過此種機制對多種腫瘤發(fā)揮殺傷作用[12-13,21-22]。ATO是Hh的天然抑制劑，安全應(yīng)用于急性早幼粒細(xì)胞白血病(Acute promyelocytic leukemia,APL)臨床治療近40年[17]，不僅具有安全性，而且對Hh抑制劑耐藥的患者也有抑制效果。鑒于ATO對Hh通路抑制作用的研究現(xiàn)狀，本研究將ATO作用于CML細(xì)胞株K562，以期探討ATO對CML細(xì)胞該通路的作用效果。

我們首先探討了ATO對CML細(xì)胞株Hh通路分子mRNA表達的影響,發(fā)現(xiàn)ATO對Hh通路的核心轉(zhuǎn)錄因子Gli1和Gli2具有劑量依賴性抑制作用，而對Hh通路的抑制因子ptch具有劑量依賴性上調(diào)作用。在相似濃度，ATO對CML細(xì)胞株Hh通路分子mRNA表達的影響與對P210/Bcr-Abl蛋白表達的影響一致，并且對Hh通路分子mRNA表達的影響在0.5 μM即已發(fā)生，早于P210/Bcr-Abl蛋白表達的變化。說明，ATO對Hh通路的影響并非發(fā)生于降解P210/Bcr-Abl蛋白之后。因此，ATO對CML細(xì)胞Hh通路的抑制具有特異性。

總之，在CML細(xì)胞中，ATO對Hh通路具有顯著的抑制作用，主要是通過抑制轉(zhuǎn)錄因子Gli1和Gli2mRNA表達，并同時上調(diào)Hh通路抑制因子ptch的mRNA表達發(fā)揮作用。該作用具有特異性，與ATO對P210/Bcr-Abl蛋白的降解無關(guān)。本研究為擴大ATO應(yīng)用于IM耐藥的CML提供了一個堅實的理論基礎(chǔ)。