談云，　陳姝穎，　湯俊明，　喬國洪，　何超，　毛旭華

肺癌是發(fā)病率較高的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占80%，大部分患者發(fā)現(xiàn)時已處中晚期[1-2]。目前，以表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)為代表的分子靶向藥物治療是晚期NSCLC有效且低毒性的治療方法。而體細(xì)胞EGFR基因突變是對EGFR-TKI靶向治療是否有效的主要依據(jù)。高分辨率熔解曲線(high resolution melting，HRM)是2003年出現(xiàn)的一種基因序列分析技術(shù)，具有閉管操作不易污染，檢測快速、準(zhǔn)確、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)[3]。我們采用HRM法對NSCLC患者胸水中EGFR基因突變進(jìn)行檢測研究，探討該方法臨床應(yīng)用價(jià)值。

1　資料與方法

1.1標(biāo)本收集

收集2015年1月至2016年11月，江蘇大學(xué)附屬宜興市人民醫(yī)院經(jīng)細(xì)胞學(xué)檢查確診為NSCLC的30例患者胸水作為研究對象，其中男13例，女17例，年齡38～72歲，中位年齡62歲。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1DNA制備取30 ml胸水，3 000 r/min離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞沉淀，保存于-80 ℃?zhèn)溆?。選用Omega Blood DNA Kit D3392血液DNA提取試劑盒(美國Omega Biotek公司)提取細(xì)胞沉淀DNA，并進(jìn)行DNA純度及濃度檢測。

1.2.2高分辨率熔解曲線法引物設(shè)計(jì)及反應(yīng)體系與反應(yīng)條件HRM法引物設(shè)計(jì)見表1。HRM法檢測儀器采用Roche LightCycler 480 system(瑞士羅氏公司)。總反應(yīng)體積為20 μl，其中包括Light Cycler HRM Master Reaction Mix(瑞士羅氏公司)， 200 nmol/L引物，3 mmol/L MgCl2和樣品DNA模板。HRM法反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，然后95 ℃變性10 s，65 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，45個循環(huán)(采用touch down技術(shù)，前10個循環(huán)退火溫度從65 ℃降到55 ℃，每個循環(huán)降1 ℃)。擴(kuò)增結(jié)束后直接進(jìn)行HRM分析，反應(yīng)條件為95 ℃1 min，40 ℃1 min，熔解曲線數(shù)據(jù)收集從70 ℃到95 ℃，溫度上升速率為1 ℃/s，40 ℃冷卻[4-5]。

表1　HRM法引物

1.3檢測方法

所有檢測標(biāo)本均同時用HRM法與Sanger測序法進(jìn)行檢測，對兩種方法檢測結(jié)果進(jìn)行對比分析。分析敏感性和特異性。

2　結(jié)果

2.1EGFR基因突變檢測結(jié)果

HRM法檢測EGFR基因18至21外顯子突變總檢出率為26.67%(8/30)，18至21外顯子突變檢出例數(shù)分別為1例、4例、0例、3例。Sanger測序法檢測總檢出率為23.33%(7/30)，其中18外顯子檢出G719C突變1例，19外顯子檢出缺失突變3例，20外顯子未檢出突變，21外顯子檢出L858R突變3例，見表2。圖1為實(shí)驗(yàn)中選取的HRM法突變示意圖，圖2～4為測序法典型突變示意圖。

表2　HRM法和Sanger測序法檢測EGFR基因突變結(jié)果統(tǒng)計(jì)

圖1　HRM法檢測EGFR基因突變示意圖

圖2　EGFR基因18外顯子G719C突變

圖3　EGFR基因19外顯子缺失突變

圖4　EGFR基因21外顯子L858R突變

2.2HRM法特異性和敏感性

HRM法與Sanger測序法相比，敏感性為100%，特異性為95.83%。陽性預(yù)測值為88.89%，陰性預(yù)測值為100%。HRM法與“金標(biāo)準(zhǔn)”Sanger測序法相比，敏感性與特異性均符合臨床檢測要求。

3　討論

表皮生長因子(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一種跨膜糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性。它能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲、轉(zhuǎn)化、血管生成及轉(zhuǎn)移[4，6]。EGFR基因突變是患者是否對酪氨酸激酶抑制劑敏感的強(qiáng)預(yù)測因子[7]。EGFR基因突變主要發(fā)生在 18至21外顯子上[8]。因此，對EGFR基因18至21外顯子基因突變的檢測可為NSCLC患者靶向治療提供重要依據(jù)。

傳統(tǒng)EGFR基因檢測標(biāo)本通常來自手術(shù)組織樣本，在實(shí)際臨床檢測中，常無法獲取腫瘤組織標(biāo)本。如大部分NSCLC患者在首診時已失去手術(shù)治療的機(jī)會，無法獲取手術(shù)組織樣本，或者既往雖有手術(shù)病史，但石蠟標(biāo)本歷時太久，無法進(jìn)行基因檢測等。肺穿刺及支氣管鏡檢查等方式獲取的組織是EGFR基因檢測標(biāo)本的另一來源，通常這些標(biāo)本組織含量較少，混合大量雜質(zhì)，增加了EGFR基因檢測的難度。因此，尋找組織標(biāo)本的良好替代物及檢測方法極為重要。有研究表明，胸腔積液和血液可作為基因檢測新途徑[9-10]。

目前，Sanger測序法和ARMS法是臨床檢測EGFR基因突變的主要方法。作為基因檢測“金標(biāo)準(zhǔn)”的Sanger測序法，其檢測靈敏度有限，10 ng基因組條件下突變含量要達(dá)到20%的DNA樣本才可準(zhǔn)確檢測。因此對于腫瘤組織DNA含量低，基因突變比例低的樣本，采用Sanger測序法易產(chǎn)生假陰性。同時Sanger測序法操作繁瑣，反復(fù)開蓋易污染，檢測周期需3 d。ARMS法操作簡便僅1 d即可完成，檢測靈敏度達(dá)1%，但目前使用的商用檢測試劑盒價(jià)格昂貴。HRM技術(shù)由PCR擴(kuò)增技術(shù)與熔解曲線分析技術(shù)相結(jié)合。原理是擴(kuò)增含突變位點(diǎn)基因的過程中，由于突變位點(diǎn)不匹配會導(dǎo)致雙鏈DNA在升溫過程中先解開，熒光染料從局部解鏈的DNA分子上釋放，從熒光強(qiáng)度與時間曲線上就可判斷是否存在突變位點(diǎn)[4]。HRM技術(shù)具有操作簡單，閉管操作不易污染，檢測快速僅需1 d、成本低于商用檢測試劑盒[3]。文獻(xiàn)報(bào)道，HRM技術(shù)理論檢測限為5%[3，11]，靈敏度高于直接測序法。但HRM技術(shù)只能對已知突變進(jìn)行檢測，并且只能檢出有無突變而無法確定具體突變類型。對于EGFR基因，前期已有大量研究，未知突變極少，通過引物設(shè)計(jì)優(yōu)化，HRM技術(shù)的局限性對臨床檢測影響較小。

本研究顯示，HRM法突變檢出率(26.67%)略高于Sanger測序法(23.33%)。因胸水中腫瘤細(xì)胞含量的不確定性，所以臨床檢測中需要高靈敏度的檢測方法，已初步體現(xiàn)出HRM法靈敏度高的優(yōu)勢。文獻(xiàn)報(bào)道，EGFR基因突變率為36.4%～66.3%[12]。本研究突變檢出率低于文獻(xiàn)報(bào)道，推測可能是NSCLC患者胸水中腫瘤細(xì)胞含量及腫瘤細(xì)胞中EGFR基因突變的比例過低，低于HRM法的檢測下限而導(dǎo)致假陰性，或者是由于樣本量小，具體原因還需進(jìn)一步研究。本研究中EGFR基因突變集中在19外顯子和21外顯子突變，與其他學(xué)者[13-15]研究一致。由于樣本量較小，未能檢測到EGFR基因20外顯子突變?？傊琀RM技術(shù)靈敏度高，快速，準(zhǔn)確，廉價(jià)，閉管操作等，適用于檢測NSCLC患者胸水中EGFR基因突變。