代少華，李　超，2，李志騫，陸江一，王天宇，董　強(qiáng)*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.錯(cuò)那縣覺拉鄉(xiāng)人民政府，西藏錯(cuò)那 856700；3.陜西省畜牧產(chǎn)業(yè)試驗(yàn)示范中心，陜西涇陽 713702)

腹瀉是導(dǎo)致犢牛生長發(fā)育障礙甚至死亡的主要疾病之一[1]，病因主要包括感染性因素、營養(yǎng)性因素和環(huán)境性因素。根據(jù)引起腹瀉的致病因素的不同可將感染性腹瀉分為細(xì)菌性腹瀉、病毒性腹瀉和寄生蟲性腹瀉3類[2]。營養(yǎng)性因素包括飼養(yǎng)管理不當(dāng)，吃奶過多或吃了難以消化的飼料等造成犢牛腹瀉；環(huán)境性因素為一年四季均可發(fā)生，尤其以春初、夏末、秋初為多發(fā)期；以出生3周齡內(nèi)的犢牛易發(fā)性高。犢牛發(fā)生腹瀉時(shí)的臨床癥狀通常采食減少或廢絕，精神沉郁，嘔吐、脫水和體型消瘦，特征性臨床癥狀為排出稀糞、水樣糞或者軟糞。如果不及時(shí)的診斷、治療，則易導(dǎo)致機(jī)體抵抗力下降甚至死亡，給養(yǎng)殖場帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。本研究在2016年11月至2017年5月間，對1 478頭奶牛，其中犢牛159頭，進(jìn)行腹瀉及其病因情況調(diào)查。對其中的55例腹瀉犢牛的血液和糞便中病原進(jìn)行檢測，為該地區(qū)的犢牛腹瀉的防治提供基礎(chǔ)資料。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1主要儀器與耗材50 mL離心管臺式離心機(jī)，Sigma公司產(chǎn)品；低速臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；全波長酶標(biāo)儀，美國伯騰(BioTek)公司產(chǎn)品；一次性真空采血管(含肝素鈉抗凝劑，不含抗凝劑兩種)，瀏陽市三力醫(yī)用科技發(fā)展公司產(chǎn)品。

1.1.2主要試劑盒牛病毒性腹瀉病毒抗原檢測試劑盒，Idexx公司產(chǎn)品；犢牛腹瀉抗原四聯(lián)快速檢測卡(隱孢子蟲、輪狀病毒、賈第蟲和大腸埃希菌K99)(BioNote)，安捷(韓國)公司產(chǎn)品。

1.2　方法

1.2.1調(diào)查方法通過詢問奶牛場獸醫(yī)和犢牛腹瀉發(fā)病的情況，包括牛群的數(shù)量、發(fā)病頭數(shù)、臨床癥狀、發(fā)病史、治療藥物和效果等，對患病犢牛進(jìn)行樣品采集。

1.2.2血液和糞便樣品的采集血漿樣品的來源：1號奶牛場35份犢牛血漿樣品和2號奶牛場20份犢牛血漿樣品，常溫保存，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室離心備用。用含有肝素鈉抗凝劑和不含抗凝劑的兩種采血管對患病犢牛各采血10 mL，做好標(biāo)記；3 000 r/min離心10 min，分別獲得血漿和血清，置-20℃保存待測。糞便樣品的來源：1號奶牛場35份犢牛糞便樣品和2號奶牛場20份犢牛糞便樣品，裝于50 mL離心管中防止污染，常溫保存?zhèn)溆?。直腸采集新鮮糞便30 g，裝于50 mL離心管中(糞樣有形成分的破壞會(huì)導(dǎo)致病原菌死亡或腐生性原蟲的污染，所以應(yīng)避免糞樣混有尿液、污水和消毒劑)。對樣品做好標(biāo)記。

1.2.3犢牛腹瀉病原的檢測采用Idexx公司牛病毒性腹瀉病毒抗原檢測試劑盒檢測，具體操作過程參照試劑盒使用說明書；采用韓國安捷(BioNote)犢牛腹瀉抗原四聯(lián)快速檢測卡檢測寄生蟲，具體操作過程參照試劑盒使用說明書。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 5分析軟件進(jìn)行分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=3)，數(shù)據(jù)用t-test方法進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2　結(jié)果

2.1　犢牛腹瀉情況調(diào)查

1號奶牛場奶牛存欄478頭，其中犢牛75頭，平均每月發(fā)病5頭，發(fā)病率為6.67%；2號奶牛場奶牛存欄1 000頭，其中犢牛84頭，平均每月發(fā)病4頭，犢牛發(fā)病率為4.76%，總體發(fā)病率為5.66%(表1)。

表1　犢牛腹瀉平均每月發(fā)病情況

2.2　牛病毒性腹瀉病毒的檢測結(jié)果

對1號奶牛場35份血漿樣品檢測，2號奶牛場20份血漿樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果均為陰性，未檢出牛病毒性腹瀉病毒(表2)。

表2　BVDV檢測結(jié)果

2.3　輪狀病毒、大腸埃希菌K99、賈第蟲和隱孢子蟲檢測結(jié)果

對兩個(gè)奶牛場總共55份(1號奶牛場35份，2號奶牛場20份)犢牛糞便樣品分兩批,使用犢牛腹瀉抗原四聯(lián)快速檢測卡進(jìn)行檢測。1號奶牛場檢測結(jié)果顯示，輪狀病毒陽性率20%，大腸埃希菌K99陽性率30%，隱孢子蟲陽性率20%，賈第蟲未檢出；2號牛場檢測結(jié)果顯示，輪狀病毒陽性率25%，隱孢子蟲陽性率75%，賈第蟲陽性率25%，大腸埃希菌K99未檢出(表3)。

表3　奶牛場糞便樣品檢測結(jié)果

3　討論

通過牛病毒性腹瀉病毒抗原檢測試劑盒和隱孢子球蟲-牛輪狀病毒-大腸埃希菌K99-賈第蟲四聯(lián)快速檢測試劑盒對幾個(gè)犢牛腹瀉主要病因進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，1號奶牛場(共35份犢牛糞樣，35份犢牛血漿樣品)檢測結(jié)果為大腸埃希菌K99陽性率33%，隱孢子蟲陽性率20%，輪狀病毒陽性率20%，賈第蟲和牛病毒性腹瀉病毒均未檢出，未出現(xiàn)死亡病例，存在2種病原的混合感染。可見該奶牛場表現(xiàn)為多種病因同時(shí)存在，無法判定某一種致病因素為主要病因，可能是由于犢牛抵抗力較弱導(dǎo)致各種腹瀉病原的混合感染。因此，除了針對檢測出已存在的致病因素對犢牛腹瀉進(jìn)行防控以外，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理水平也是十分必要的。

2號奶牛場(共20份犢牛糞樣，20份犢牛血漿樣品)檢測結(jié)果為隱孢子蟲陽性率75%，輪狀病毒陽性率25%，賈第蟲陽性率25%，大腸埃希菌K99未檢出，未出現(xiàn)死亡病例，存在2種病原的混合感染，未對病牛進(jìn)行牛病毒性腹瀉病毒的檢測，該場同樣表現(xiàn)為多種病原同時(shí)存在，但其中隱孢子蟲感染情況最為嚴(yán)重，應(yīng)引起養(yǎng)殖戶的注意，隱孢子蟲通過食物、水源以及直接或間接接觸均能進(jìn)行傳播。根據(jù)該牛場的飼養(yǎng)管理來看，可能與水源的污染有關(guān)，但地下水被污染的原因還有待調(diào)查。因此，養(yǎng)殖場若要控制該病的發(fā)病率，應(yīng)注意飲水衛(wèi)生以及圈舍的消毒，隱孢子蟲的卵囊多在晚間排出，所以應(yīng)安排在清晨對病舍進(jìn)行清掃消毒。隱孢子蟲卵囊對外界的抵抗力較強(qiáng)，常規(guī)的消毒方法不能將其殺滅。但是用100 mL/L福爾馬林、50 mL/L氨水或65℃以上30 min均可殺死卵囊。此外，含氯消毒劑對飲用水中的隱孢子蟲具有良好的殺滅效果，殺滅率可大于99%[3]。輪狀病毒和賈第蟲陽性率雖不及隱孢子蟲，但不能忽視其仍可能是造成犢牛腹瀉的病因，需同樣在防控工作上予以關(guān)注。

本次檢測結(jié)果顯示，病原的總體感染率由高到低依次為隱孢子蟲35.7%、輪狀病毒21.4%、大腸埃希菌K99 21.4%、賈第蟲7.1%，牛病毒性腹瀉病毒未檢出。可以看出隱孢子蟲的感染情況最為嚴(yán)重，應(yīng)予以足夠重視。本次調(diào)查未檢出牛病毒性腹瀉病毒，可初步認(rèn)為牛病毒性腹瀉病毒不是楊凌這2個(gè)奶牛場犢牛腹瀉的主要原因。根據(jù)調(diào)查結(jié)果2個(gè)奶牛場均在犢牛出生后1 h內(nèi)灌喂4 L經(jīng)產(chǎn)牛初乳，100%犢牛在1 h內(nèi)飼喂初乳；初乳灌喂4 h后進(jìn)行常乳飼喂，1日3次，調(diào)查過程中未見其他異常[5]；可排除因初乳飼喂不足或不及時(shí)所導(dǎo)致的營養(yǎng)性因素引起的腹瀉。

本次調(diào)查雖然在腹瀉病牛樣品中檢測到一些病原，但仍有一部分樣品未檢測到病原。造成該情況的原因可能是實(shí)驗(yàn)室檢測病原的種類有限，未檢測到真正的致腹瀉病原；也有可能是樣品在保存過程中一些病原遭到破壞，導(dǎo)致未被檢出。今后可對楊凌周邊其他奶牛場進(jìn)行采樣檢測，擴(kuò)大檢測樣本數(shù)量，并增加病原檢測種類，比如沙門菌、球蟲等，從而提高結(jié)果的可參考性和可引用性。