羅　會，郭晴晴，呂愛平，何小鵑*，馬超英

(1.西南交通大學生命科學與工程學院，四川成都 610031；2.中國中醫(yī)科學院中醫(yī)臨床基礎醫(yī)學研究所，北京 100700；3.香港浸會大學中醫(yī)藥學院，香港 999077)

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)是一類發(fā)生在人中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)的自身免疫引起的神經(jīng)退行性疾病[1]。目前MS仍無有效的治愈方法，只能利用藥物減緩其進展，控制病癥[2]。MS的發(fā)病機制尚未明確，近年來大多數(shù)的研究傾向于認為MS是由T淋巴細胞介導的自身免疫性疾病。當抗原遞呈細胞在病毒感染或其他刺激因子的作用下活化的同時，共刺激分子與T細胞結(jié)合提供共刺激信號，特異性激活針對髓鞘抗原的自身反應性CD4+T細胞，后者增殖并分化穿過血腦屏障進入CNS與自身抗原結(jié)合，發(fā)生免疫反應，破壞血腦屏障，從而使大量免疫細胞進入CNS，并分泌多種淋巴因子破壞神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞，從而導致以髓鞘脫失和軸索變性為特征的神經(jīng)系統(tǒng)損傷[3-4]。

實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型(experimentally allergic encephalomyelitis，EAE))是人類模擬MS的經(jīng)典實驗動物模型，在臨床表征和病理特征上與MS相似[5]。對MS和EAE動物模型發(fā)病機理的研究，均證明CD4+T細胞是對自身抗原免疫應答的主要細胞，在整個EAE的發(fā)生和發(fā)展過程中都發(fā)揮重要作用，也在多個部位，包括外周脾和CNS病灶部位都發(fā)揮致病效應[6]。因此，研究不同時期不同部位EAE模型的CD4+T細胞的特征，可以更清晰地了解CD4+T細胞在EAE疾病進程中的變化規(guī)律，有利于對EAE的疾病進展有更清晰的認識。

因此，本研究采用C57BL/6小鼠建立單向進展型EAE模型，通過檢測外周脾和CNS在疾病不同時期CD4+T細胞，來研究不同部位的CD4+T細胞在疾病發(fā)展過程的動態(tài)變化。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實驗動物SPF級雌性C57BL/6小鼠共25只，10周齡～12周齡，購自北京維通利華實驗技術(shù)有限公司,動物許可證號：SCXK(京)2016—0011，飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所動物實驗室,動物許可證號：SYXK(京)2016—0021。所有動物試驗前先進行適應性飼養(yǎng)1周，溫度20℃～25℃，相對濕度40%～60%，維持晝夜交替12 h光照，自由飲水及進食，分籠(每籠5只)進行飼養(yǎng)。試驗遵守中國中醫(yī)科學院相關(guān)規(guī)則制度，符合動物倫理道德規(guī)范。

1.1.2試劑髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白35-55多肽(MOG35-55:H-Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Ser-Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys-OH)，HPLC純度98.79%，上海強耀生物科技有限公司合成；完全弗氏佐劑(complete Freund adjuvant,CFA：含熱滅活結(jié)核分支桿菌H37Ra5 mg/mL)，美國Chondrex公司產(chǎn)品；百日咳毒素(pertussis toxin,PTX))，美國List Biological Laboratories公司產(chǎn)品；流式CD3和CD4抗體， BD公司產(chǎn)品；免疫組化CD4抗體，美國Abcam公司產(chǎn)品；免疫組化二抗(SignalStain○RBoost IHC Detection Reagent,HRP,Rabbit)、DAB顯色試劑盒(SignalStain○RDAB Substrate Kit)，美國Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品。

1.2　方法

1.2.1動物分組及EAE造模雌性C57BL/6小鼠按體重隨機分為空白組、模型1、模型2、模型3和模型4組，共5組，每組5只。MOG35-55多肽用磷酸鹽緩沖液(PBS)充分溶解并稀釋后與CFA等體積混合，在冰浴中用勻漿機進行勻漿制得油包水狀的抗原乳化物。Day 0于模型組小鼠上腹部分兩點皮下注射含200 μg MOG35-55多肽的抗原乳劑共200 μL，并于Day 0、Day 2分別給予每只小鼠腹腔注射200 ng PTX，誘導單向進展型EAE模型[7]。

空白組于Day 0取材，模型1組于Day 17取材，模型2組于Day 25取材，模型3組于Day 40取材，模型4組于Day 52取材。

1.2.2檢測

1.2.2.1動物一般情況觀察從Day 0開始，每天對小鼠狀態(tài)進行觀察，對各組小鼠進行神經(jīng)功能評分。評分標準參考5分評分法，雙盲法進行如下評分：1分：尾部張力降低；2分：中度后肢或前肢無力；3分：重度后肢或前肢無力；4分：四肢完全癱瘓；5分：瀕死狀態(tài)或死亡。中間情況以±0.5分計，小鼠神經(jīng)功能評分≥1分，即為發(fā)病[8]。

1.2.2.2脾單個核細胞分離處死小鼠，取脾，于細胞篩中研磨，細胞勻漿用細胞過濾器過濾，得到脾勻漿。脾勻漿于4℃、1 500 r/min離心5 min，收集脾細胞沉淀。加入紅細胞裂解液2 mL，室溫反應5 min，加入2 mL培養(yǎng)基終止裂解。離心去上清，PBS清洗，得到脾單個核細胞[9]。

1.2.2.3流式細胞儀檢測將脾單個核細胞按照每管1×106細胞/管分裝于流式管中，用200 μL PBS進行混懸，常溫避光條件下添加CD3和CD4抗體染色20 min。流式管加入2 mL PBS，混勻后300 r/min離心5 min，倒棄上清，剩余50 μL～100 μL液體，加入100 μL PBS 重懸后，上機檢測。

1.2.2.4腦和脊髓固定及切片小鼠用5 mg/mL戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔注射麻醉，剪開胸部，將灌注針由左心室穿入主動脈，剪開左心耳，依次注入9 g/L生理鹽水、40 g/L多聚甲醛灌注固定。然后完整取出全腦和脊髓，分別切取大腦視交叉層面2 mm左右的腦組織、腦干、頸髓、胸髓及腰髓固定于100 mL/L中性福爾馬林48 h。固定的標本以0.01 mol/L pH 7.4的PBS沖洗，在梯度乙醇溶液(700、800、950、950、1 000、1 000 mL/L)中脫水，二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋制備成蠟塊。組織切片機取5 μm厚度連續(xù)切片，每間隔20 μm取1張，60℃烤干切片備用。

1.2.2.5免疫組化石蠟切片脫蠟至水，置于0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)在微波爐內(nèi)微波輻射10 min進行抗原修復，之后取出自然冷卻，蒸餾水洗3次，每次5 min。滴加30 mL/L H2O2室溫孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min。滴加30 mg/mL BSA封閉30 min，去除封閉液，滴加稀釋1 000倍的CD4抗體，4℃孵育過夜，PBS洗3次，每次5 min。滴加二抗，室溫孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min。DAB顯色5 min，脫水，封片。免疫組化切片按照同一采集參數(shù)拍攝，每張切片隨機采集圖像10張，采用IPP(Image Pro Plus)圖像分析軟件進行免疫組化定量分析，選擇陽性細胞積分光密度值(integrated optical density,IOD)作為免疫組化結(jié)果半定量分析的指標。

2　結(jié)果

2.1　小鼠的病情變化

小鼠從Day 14開始發(fā)病，發(fā)病率為100%，EAE小鼠發(fā)病表現(xiàn)為活動少，進食少，精神頹靡。隨后幾天逐漸出現(xiàn)尾部松弛無力，步態(tài)蹣跚，雙后肢依次呈現(xiàn)麻痹狀態(tài)，行動困難的臨床癥狀，臨床評分隨著時間延長加重，到達高峰期后癥狀稍微緩解，之后則基本保持在3分不變。發(fā)病過程如圖1所示。

2.2　脾CD4+ T細胞的動態(tài)變化

流式細胞儀檢測S1、S2、S3、S4這4個時期EAE小鼠的脾中CD4+T細胞比例，與空白組相比發(fā)病后CD4+T細胞比例顯著增加，并出現(xiàn)先上升后降低的趨勢，CD4+T細胞比例在S2期達到最大值，隨后降低(圖2)。

S1.發(fā)病初期；S2.發(fā)病高峰期；S3.平臺初期；S4.平臺后期

S1.Onset period;S2.Peak period;S3.Early platform period;S4.Late platform period

圖1EAE小鼠發(fā)病評分

Fig.1Clinical score of EAE mice

S1.發(fā)病初期；S2.發(fā)病高峰期；S3.平臺初期；S4.平臺后期

S1.Onset period;S2.Peak period;S3.Early platform period;S4.Late platform period

圖2不同時間點脾中CD4+T細胞流式結(jié)果

Fig.2The percentage of CD4+T cells in spleen detected by flow cytometry at different periods

2.3　中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同時期不同部位CD4+ T細胞的免疫組化結(jié)果

免疫組化檢測S1、S2、S3、S4這4個不同時期，EAE小鼠大腦、腦干、頸髓、胸髓、腰髓的CD4+T細胞的浸潤情況，結(jié)果如圖3所示。相較于正常組小鼠，EAE小鼠的大腦、腦干和各段脊髓在各個時期中均出現(xiàn)較為明顯的CD4+T細胞浸潤，其中脊髓的浸潤情況最明顯，其次是大腦，再次腦干。在EAE的發(fā)展過程中，各個部位的CD4+T細胞的動態(tài)變化特點一致，均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。不同的是，大腦、腦干、胸髓和腰髓在S2期達到最大值，而頸髓在S3期達到最大值。

3　討論

MS及其動物模型EAE是一類主要由T細胞介導的自身免疫性疾病，CD4+T細胞在EAE的發(fā)病中起到關(guān)鍵的作用[19]。對MS和EAE動物模型發(fā)病機理的研究，均證明CD4+T細胞是對自身抗原免疫應答的主要細胞[11]。而當激活的自身反應性CD4+T細胞進入CNS后，增殖分化，并分泌多種炎癥因子，對CNS起到破壞作用[12]。因此，CD4+T細胞在整個EAE的發(fā)生和發(fā)展中都發(fā)揮重要作用，也在多個部位，包括外周脾和CNS病灶部位都發(fā)揮致病效應[13]。為了對EAE的發(fā)病過程以及CD4+T細胞在疾病發(fā)展過程中的作用有更加清楚地認識，了解在外周和CNS的CD4+T細胞隨疾病進展的動態(tài)變化是十分必要的。

S1.發(fā)病初期；S2.發(fā)病高峰期；S3.平臺初期；S4.平臺后期

S1.Onset period;S2.Peak period;S3.Early platform period;S4.Late platform period

圖3不同時期CNS不同部位CD4+T細胞免疫組化結(jié)果(200×)

Fig.3Immunohistochemistry result of CD4+T cells infiltration in different parts of CNS at different periods(200×)

本研究發(fā)現(xiàn)，相對于空白組小鼠，EAE小鼠的脾和CNS中的CD4+T細胞均顯著增加，這與之前的研究是一致的，再次證明CD4+T細胞在EAE疾病發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。另外，脾和CNS的CD4+T細胞隨疾病進展的動態(tài)變化一致，基本于發(fā)病初期上升，發(fā)病高峰期出現(xiàn)峰值，平臺初期下降，該結(jié)果提示CD4+T細胞可能在發(fā)病初期和發(fā)病高峰期發(fā)揮較重要的致病效應。在平臺期，CD4+T細胞反而有所下降，考慮原因可能是機體對炎性改變的自我反應所致[14]。由于CNS中的CD4+T細胞是由外周進入的，脾和CNS的CD4+T細胞隨疾病進展的動態(tài)變化一致，可以推測EAE小鼠CNS的CD4+T細胞浸潤是受外周的CD4+T細胞數(shù)量變化的影響的，故可以通過干預外周CD4+T細胞的數(shù)量來降低CNS的CD4+T細胞浸潤。

在EAE模型中，大腦、腦干和脊髓中均為炎癥部位[15]，研究CNS不同部位CD4+T細胞浸潤情況，可以增加對EAE病理特點的認識，同時為進行EAE的CD4+T細胞相關(guān)研究的CNS取材部位提供參考。故選擇大腦、腦干、頸髓、胸髓和腰髓進行實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EAE小鼠CNS的不同部位中，以脊髓浸潤最為明顯。在EAE不同時期中，以發(fā)病初期、高峰期和平臺初期的浸潤較明顯。本研究結(jié)果提示，選取C57BL/6小鼠建立單向進展型EAE模型進行有關(guān)CD4+T細胞的研究時，取材時間不宜過長。對于CNS進行CD4+T細胞的研究盡量選取脊髓，特別是腰髓段，若需要EAE小鼠發(fā)病較長時間后研究，盡量選擇頸髓段。