都宏霞,陶勁強(qiáng),2,王 翔,劉宴秀,俞 軒

(1.南京科技職業(yè)學(xué)院化工與材料學(xué)院,江蘇南京 210048;2.南京工業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇南京 211800)

人參花是珍貴草藥五加科植物人參的花蕾[1],在我國主要生長在河北北部、黑龍江、遼寧、吉林等地[2]。人參是我國的瑰寶,近年來,國內(nèi)外學(xué)者先后對人參的根、根莖、莖、葉及果實的化學(xué)成分做了較為系統(tǒng)的研究,但對人參花資源的研究報道甚少。

人參花作為一種具有潛在藥用和食用價值的植物,也在逐漸受到大家的關(guān)注[3-4],雖然研究的不多,但也取得了一定進(jìn)展,研究主要集中在花蕾發(fā)育的細(xì)胞學(xué)特征[5]、皂苷[6-7]、多糖[8]及揮發(fā)油等其他化學(xué)成分上[9-11],劉淑瑩等通過甲醇作為萃取溶劑,經(jīng)RRLC-Q-TOF-MS/MS分析得到14種人參皂苷[6],而徐斐等通過70%的乙醇提取,得到11種人參皂苷[7],回瑞華等通過超聲波提取得到人參花多糖提取最佳工藝[8],徐斐等通過水蒸氣回流法提取并鑒定出33種人參花揮發(fā)性成分[10]。關(guān)于人參花黃酮(Ginseng Flower Flavonoids,簡稱GFF)的研究只見一篇報道,采用8種不同方法對人參花進(jìn)行炮制,比較其人參皂苷含量、黃酮、多糖的含量[11]。

黃酮類化合物是天然藥用植物的主要活性成分之一,具有多種生理功能[12-13],迄今為止還未有對GFF的提取工藝和抗氧化活性的系統(tǒng)研究,本文在單因素分析的基礎(chǔ)上,通過響應(yīng)面法優(yōu)化,初步確定GFF提取的最優(yōu)工藝,并對三種自由基的抗氧化活性進(jìn)行了測定,為GFF的研究奠定了重要的基礎(chǔ),為進(jìn)一步開發(fā)人參花資源提供了堅實的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮人參花 六年生大花,吉林省長白山土特產(chǎn)公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品 北京恒元啟天化工技術(shù)研究所;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、鄰苯三酚 Sigma公司;乙醇、三氯化鋁、醋酸鉀、FeSO4·7H2O、水楊酸、H2O2、三羥甲基氨基甲烷、濃鹽酸均為分析純。

ME204E-02型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;7600型紫外分光光度計 上海菁華科學(xué)儀器制造有限公司;TDL-50B型低速臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 GFF的提取及測定 以新鮮人參花為原料,經(jīng)過洗滌、陰干等預(yù)處理,經(jīng)超微粉碎至40目、乙醇浸泡、微波提取,轉(zhuǎn)速3000～4000 r/min,時間20～30 min進(jìn)行離心分離,取出上清液,過0.45 μm濾膜,對D101大孔樹脂進(jìn)行預(yù)處理后,上樣,待吸附平衡后,用去離子水、分別用質(zhì)量濃度為30%、50%、70%、90%的乙醇溶液洗脫,每個濃度均洗脫3柱體積(BV),流速為1 BV/h,收集90%乙醇濃度的洗脫液,于45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮后[14],再用50%的乙醇溶液進(jìn)行稀釋得到人參花黃酮樣品(GFF)。

人參花黃酮提取量的測量按文獻(xiàn)方法[15-16]并稍微修改。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液定容5.0 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品至25.0 mL。

稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(0.2 mg/mL)0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別置于6只比色管中,分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液至5.0 mL,0.1 mol/L三氯化鋁溶液3.0 mL和1 mol/L醋酸鉀溶液5.0 mL,搖勻,同法制成空白對照:靜待40 min后于415 nm波長處測其吸光度值,并通過originpro 2017軟件繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

人參花中黃酮提取量的測定:吸取2 mLGFF提取液,按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟反應(yīng)后,在415 nm處測定吸光度值,結(jié)果以人參花中含有相當(dāng)于蘆丁的毫克數(shù)表示,單位為mg/g。

式中:X表示標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出的質(zhì)量濃度(mg/mL);v表示提取液的總體積(mL);N表示稀釋倍數(shù);m表示人參花粉末的質(zhì)量(g)。

1.2.2 微波提取GFF的單因素實驗

1.2.2.1 微波功率對GFF提取量的影響 料液比1∶10,乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%,微波時間30 s,再分別取80、240、400、640、800 W的微波功率作為變量,觀察微波功率對其提取量的影響。

1.2.2.2 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對GFF提取量的影響 料液比1∶10,在微波時間30 s和微波功率為800 W的條件下,乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為40%、50%、60%、70%、80%,制備出提取液,比較該變量對其提取量的影響。

1.2.2.3 料液比對GFF提取量的影響 在50%的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù),微波功率800 W,時間30 s的條件下,分別取料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30制備出提取液,比較此變量對其提取量的影響。

1.2.2.4 微波時間對GFF提取量的影響 在50%乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù),800 W微波功率,1∶20料液比的條件下,分別取微波時間20、30、40、50、60 s,比較該變量對其提取量的影響。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化GFF最優(yōu)提取工藝條件 使用Design-Expert.V8.0.6軟件中Box-Behnken組合設(shè)計來確定實驗最優(yōu)工藝,從單因素實驗基礎(chǔ)上,選擇液料比、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、微波時間作為3因素,每個因素選擇三個對GFF提取量影響較大的水平,進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面實驗,并以GFF提取量作為響應(yīng)值,各因素的三個水平分別采取-1、0、1作為編碼,如表1。

表1 響應(yīng)面實驗分析因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.4 GFF對DPPH自由基的清除能力測定 依據(jù)Brandwilliams[17-19]等人的實驗步驟,制定實驗方案。配制0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液備用。精確吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.0 mL經(jīng)D101大孔樹脂純化過的提取液,精確吸取2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.6、0 mL和6.0 mL新配制的DPPH溶液于試劑中,避光靜待30 min后,再用分光光度法在517 nm處測定吸光度值,并用VC做陽性對照。GFF提取液對DPPH自由基的清除能力依據(jù)公式計算:

式中,I1表示對DPPH自由基的清除率(%);Ai表示GFF和DPPH溶液混合液吸光度;Aj表示無DPPH溶液吸光度;A0表示無樣品時DPPH溶液的吸光度。

1.2.5 GFF對羥自由基的清除能力測定 采用Fenton反應(yīng)來測定GFF的羥自由基清除率[20-22]。于比色管中分別加入1 mL的9 mol/L FeSO4溶液、1 mL的9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液,不同濃度用D101樹脂純化過的待測GFF提取液1 mL(空白對照以蒸餾水代替GFF提取液),最后加1 mL的8.8 mol/L H2O2溶液,水浴35 min,溫度恒定35 ℃,測其吸光度的波長為510 nm,檢測液本身有吸光度,因此測其本底值需用蒸餾水代替H2O2,并用VC做陽性對照。并根據(jù)此公式計算其清除率:

式中,I2表示對羥自由基的清除率(%):A0是空白對照實驗(蒸餾水代替GFF提取液)的吸光度;AX是加入提取液后的吸光度;AX0是檢測液本底的吸光度(蒸餾水代替過氧化氫)。

1.2.6 GFF對超氧陰離子自由基的清除能力測定 采用鄰苯三酚自氧化法[22-25]進(jìn)行測定超氧陰離子自由基清除能力,分別取4.5 mL pH8.2的Tris-HCl緩沖液于若干比色管中,20 ℃水浴25 min。每管中分別加入不同濃度經(jīng)D101樹脂純化過的待測GFF樣品溶液0.1 mL及0.3 mL 在30 ℃預(yù)熱條件下3 mmol/L的鄰苯三酚(用10 mmol/L的HCl配制),振蕩后恒溫20 ℃水浴6 min,隨滴2滴8 mol/LHCl反應(yīng)終止,空白對照選用蒸餾水,測吸光度波長為320 nm,并用VC做陽性對照。提取液對超氧自由基的清除率按公式計算。

式中,I3表示對超氧自由基的清除率(%),A0為空白對照的吸光度;An為加入GFF后的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft office excel 2013、Originpro 2017和Design-Expert.V8.0.6進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、圖表制作及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果分析

經(jīng)測定,由圖1得其回歸方程為Y=16.43412X+0.06882,其系數(shù)R2=0.99938,在0～0.08 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of Rutin

2.2 單因素實驗

2.2.1 微波功率對GFF提取量的影響 結(jié)果如圖2所示:微波功率在80～240 W之間,隨著功率的增大,GFF提取量呈上升趨勢;在240～400 W范圍內(nèi),隨著功率的增大,GFF提取量呈下降趨勢;在400～800W范圍內(nèi),隨著功率的增大,GFF提取量呈上升趨勢。GFF的提取量在800 W時最大。而在240～400 W之間下降,可能是在微波的交變電磁場作用下,引發(fā)黃酮強(qiáng)烈振蕩,導(dǎo)致分子間氫鍵斷裂,使得有少量黃酮受熱分解[26],加速了乙醇溶液的熱運動,使得一些醇溶性雜質(zhì),脂溶性成分溶出量增加,使溶液黏度變大,增大了傳質(zhì)過程中溶劑的阻力,減慢了GFF向溶劑擴(kuò)散,減少了粉末表面與溶劑之間GFF濃度差,從而導(dǎo)致GFF的提取量減少[27]。微波功率在小于800 W時,分子熱運動較慢,微波對細(xì)胞膜破壞作用較小,因此提取量不高。最高值為3.604 mg/g。

圖2 微波功率對GFF提取量的影響Fig.2 Effect of microwave power on extraction yield of GFF

2.2.2 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對GFF提取量的影響 結(jié)果如圖3所示:乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)在50%時GFF的提取量最大,而在40%～50%時,GFF的提取量呈上升趨勢,當(dāng)50%～80%時,GFF的提取量呈下降趨勢。許輝[28],劉俊[29]等人在研究中發(fā)現(xiàn)黃酮提取量隨著乙醇濃度的增加而呈現(xiàn)與本文同樣的趨勢,推測是加入乙醇溶液之后引入了羥基,乙醇分子與水分子間和其自身間均相互結(jié)合形成氫鍵,體系極性降低,故黃酮的提取量在升高,但隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加,其極性下降,導(dǎo)致了黃酮的溶解能力減弱,因此最佳乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%。此時提取量最高,提取量為3.628 mg/g。

圖3 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對GFF提取量的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on extraction yield of GFF

2.1.3 料液比對GFF提取量的影響 結(jié)果如圖4所示:GFF的提取量先高后低,此時料液比在不斷增加,料液比1∶20時人參花黃酮的提取量最大。料液比1∶20,當(dāng)料液比大于1∶20時,人參花黃酮的提取量下降。大體積的溶劑量減小了黃酮吸收的能力導(dǎo)致其溶解量減小。GFF提取量隨著料液比的升高而升高,但當(dāng)料液比達(dá)到1∶20后,提取量呈現(xiàn)下降趨勢。因為料液比的增加可以使體系的溶解度升高,促進(jìn)人參花細(xì)胞破壁,使內(nèi)容物溢出率增加,但當(dāng)溶解度大到一定程度時,可能會發(fā)生飽和的現(xiàn)象,導(dǎo)致部分黃酮無法溶解。因此最佳料液比為1∶20。提取量為5.313 mg/g。

圖4 料液比對GFF提取量的影響Fig.4 Effect of liquid-material ration on extraction yield of GFF

2.2.4 微波時間對GFF提取量的影響 結(jié)果如圖5所示:在20～30 s時提取量呈上升趨勢,此時黃酮的溶出主要受溫度控制,因此提取量隨著溫度升高而提高。但在30～60 s時反而呈下降趨勢,可能是微波加熱有升溫過程。但在30～60 s階段溫度已經(jīng)穩(wěn)定,大部分細(xì)胞膜已經(jīng)破壞,黃酮的溶出速度受分子擴(kuò)散速度,因此提取量隨著時間增加而降低,最大條件為30 s。此時提取量最高為5.359 mg/g。

圖5 微波時間對GFF提取量的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction yield of GFF

2.3 響應(yīng)面實驗結(jié)果與優(yōu)化分析

2.3.1 響應(yīng)模型的建立與分析 Box-Behnken實驗結(jié)果：根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選取響應(yīng)面實驗因素為A料液比、B乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)、C微波時間(s),GFF為響應(yīng)值(Y),采用Design-expert軟件按照Box-Benhnken實驗設(shè)計了15組實驗,12組為析因點實驗,3組為重復(fù)零點實驗,結(jié)果見表2對人參花黃酮提取量的影響進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化需對3個自變量進(jìn)行編碼,以GFF提取量作為響應(yīng)值。實驗設(shè)計方案及響應(yīng)面數(shù)據(jù)結(jié)果分析見表2,方差與誤差統(tǒng)計分析見表3。

表2 響應(yīng)面Box-Benhnken 實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of the response surface methodology(RSM)and Box-Behnken

在表2中進(jìn)行分析并建立如下二次回歸方程(編碼方程):Y(黃酮提取量)=4.83+0.12A-(1.250E-003)B+0.055C-0.046AB-0.069AC-0.010BC-0.62A2-0.12B2-0.40C2

表3的數(shù)據(jù)可知:模型的p值為0.0037,模型顯著(p<0.05);失擬項p值為0.1260,結(jié)果不顯著(p>0.05),表明擬合狀況良好。方程決定系數(shù)R2=0.9656,CV為6.64%<10%,能真實的反映本模型,可用此模型分析響應(yīng)面的變化。信噪比(Adeq Precision)為11.396大于4,表示模型合理[30]。

由方差F值可知,各因素對GFF提取量影響為:B(乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù))>C(微波時間)>A(料液比)。由表3還可知,因素中B的影響顯著,而A,C,AB,AC,BC的影響不顯著,該方程可適用。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.3.2 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化 各因素間交互作用得到響應(yīng)面曲線圖。圖6～圖8分別顯示3個結(jié)果分析,并繪制響應(yīng)面曲線圖。當(dāng)黃酮的提取量相同時等高線圖在同一曲線上[31-32]。在密閉區(qū)域內(nèi),GFF值從中心向四周下降。當(dāng)?shù)雀呔€排列緊密,表明操作條件與響應(yīng)值改變較為明顯。等高線圖直觀表示2變量之間交互作用,此時橢圓形則為顯著[30]。

圖6 料液比與乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)響應(yīng)面圖Fig.6 Response Surface of Y=f(A,B)

圖7 微波時間與料液比響應(yīng)面圖Fig.7 Response Surface of Y=f(A,C)

圖8 微波時間與乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)響應(yīng)面圖Fig.8 Response Surface of Y=f(B,C)

分析圖6三維曲面圖可以看出,料液比曲面比乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)曲面坡度陡峭,固定另一因素不變,即表明料液比對人參花黃酮提取量的影響比乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響大。同理再分析圖7三維曲面圖可以得出料液比比微波時間對人參花黃酮提取量的影響大,這與二元回歸方程系數(shù)相符合,圖8中微波時間與乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的曲面坡度均陡峭,交互作用明顯,這與方差分析表一致。

可從各響應(yīng)面立體圖觀測出響應(yīng)面有最值。通過軟件得出理論最佳提取工藝:微波功率800 W,微波時間29.69 s,乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為54.21%,料液比1∶21.43,理論黃酮提取量為5.6502 mg/g,結(jié)合實驗室條件修正為800 W,微波時間30 s,54%的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù),料液比1∶21,最終實驗結(jié)果為5.624 mg/g,與理論值相差0.03%,說明模型與實際情況擬合較好,驗證了所預(yù)測模型的正確性。因此,響應(yīng)面法對微波輔助人參花黃酮提取的參數(shù)優(yōu)化是可行的,得到的工藝條件具有實際應(yīng)用價值。

2.4 GFF對自由基的清除能力結(jié)果分析

2.4.1 GFF對DPPH自由基的清除能力結(jié)果分析 不同濃度的人參花黃酮提取液與VC溶液對DPPH自由基清除能力如圖9所示。從圖中可以看出,VC在1 mg/g左右達(dá)到最大值,且在之后基本不變。GFF對DPPH自由基的清除能力比VC差。DPPH自由基清除率隨著GFF提取量的增加,也在不斷升高,當(dāng)人參花黃酮濃度是0.24 mg/mL時,清除率最大為71.47%,人參花黃酮和VC的IC50值分別為0.17 mg/mL和0.09 mg/mL。

圖9 GFF對DPPH自由基清除能力Fig.9 Scavenging effect of GFF on DPPH radical

2.4.2 人參花黃酮對羥自由基的清除能力結(jié)果分析 不同濃度的人參花黃酮提取液與VC溶液對羥自由基清除能力如圖10所示,從圖中可以看出,GFF對羥自由基具有一定的抑制能力但不如VC顯著,羥自由基與GFF提取量有量效關(guān)系,呈正相關(guān),當(dāng)人參花黃酮濃度在0.24 mg/mL時,清除率最大為49.91%,人參花黃酮和VC溶液的IC50為0.24 mg/mL和0.30 mg/mL。

圖10 GFF對羥自由基清除能力Fig.10 Scavenging effect of GFF on hydroxyl free radicals

2.4.3 GFF對超氧陰離子自由基的清除能力結(jié)果分析 不同濃度的人參花黃酮提取液與VC溶液對超氧陰離子自由基清除能力如圖11所示。從圖11中可以明顯看出GFF和VC溶液對超氧自由基都有一定的抑制能力,抑制率與濃度呈良好的量效關(guān)系,且GFF比VC溶液對超氧自由基的抑制能力要好,當(dāng)人參花黃酮濃度是0.24 mg/mL時,有最大清除率72.32%,人參花黃酮和VC溶液的IC50分別為1.73 mg/mL和0.14 mg/mL。

圖11 GFF對超氧自由基的清除能力Fig.11 Scavenging effect of GFF on superoxide anion free radical

2.4.4 GFF對3種自由基清除率的比較 通過實驗比較發(fā)現(xiàn),GFF對3種自由基均具有清除能力,且抑制率與GFF提取量成正比,72.32%(超氧自由基清除率)>71.47%(DPPH自由基清除率)>49.91%(羥自由基清除率),且超氧自由基和DPPH自由基的活性相似。羥自由基是已知最活潑的氧化劑且反應(yīng)范圍廣[33],因此GFF對其清除率最低。

3 結(jié)論

通過單因素實驗得出響應(yīng)面優(yōu)化條件,在使用Design-Expert軟件中的設(shè)計方法上建立數(shù)學(xué)模型。方差分析結(jié)果表明人參花黃酮提取量與乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān),與微波時間,液料比有一定影響,結(jié)合響應(yīng)面交互作用分析結(jié)果和實際情況預(yù)測最佳條件,并驗證后得出人參花黃酮提取最佳條件為微波功率為800 W,微波時間30 s,54%的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù),料液比1∶21。

人參花中黃酮的研究鮮有報道,這不僅不利于對中國傳統(tǒng)中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究,還不利于對中國自然資源的再利用。通過對人參花黃酮的研究,測量人參花黃酮的活性,有助于了解其成分功效,開發(fā)其潛在價值,研發(fā)出新的產(chǎn)品,將其工業(yè)化,擴(kuò)大人參花這一潛在市場,并以此帶動傳統(tǒng)農(nóng)產(chǎn)品和中藥材的附加價值再利用。