廖丹葵,熊珍愛,周利琴,孫麗霞,伍善廣,蘭雄雕,2,*

(1.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,廣西南寧 530004;2.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西南寧 530004;3.廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院,廣西柳州 545006;)

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)是一種膜結(jié)合的鋅依賴型二肽羧基肽酶[1],在腎素-血管緊張素系統(tǒng)中起到關(guān)鍵作用,可對(duì)體內(nèi)血壓進(jìn)行調(diào)節(jié)[2]。因此,ACE成為降血壓藥物研究的靶向分子。隨著ACE抑制劑類降血壓藥物受到研究者越來越多的關(guān)注,ACE的需求量不斷增大,但是商品ACE價(jià)格十分昂貴,實(shí)驗(yàn)成本過高,使得ACE抑制劑類降血壓藥物的研發(fā)及作用機(jī)理研究受到了一定限制。因此,尋求一種簡便的制備大量ACE的方法是十分必要的。研究表明,ACE廣泛存在于哺乳動(dòng)物組織中,如肺、腎、小腸等[3],其中肺部組織的含量最高[4]。已有文獻(xiàn)報(bào)道從各種動(dòng)物肺部組織中提取ACE,其中,豬肺具有來源廣、價(jià)格低廉的特點(diǎn),因此,以豬肺為原料制備ACE可降低ACE生產(chǎn)成本,同時(shí)也能實(shí)現(xiàn)豬肺的高值化利用。目前,ACE的純化方法主要有凝膠層析[5-6]、離子交換層析[7-8]、親和層析[9-10]等,通常需將幾種純化方法結(jié)合,才能最終得到高純度的ACE,純化步驟繁瑣,耗時(shí)長,成本高,限制了其純化工藝的發(fā)展,大多數(shù)停留在實(shí)驗(yàn)室階段的研究,工藝放大的可行性無法確定。

本課題組前期以新鮮豬肺為原材料,采用DEAE離子交換層析-超濾法對(duì)豬肺ACE進(jìn)行分離純化,得到電泳級(jí)純的ACE[11]。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上,對(duì)DEAE離子交換層析進(jìn)行放大,在盡可能低的生產(chǎn)成本下,得到高純度產(chǎn)品,為其更大規(guī)模的純化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮豬肺 購于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng);牛血清白蛋白 Aladdin試劑有限公司;馬尿酸、馬脲酰-組氨酰-亮氨酸 Sigma公司;DEAE Sepharose FF離子交換樹脂 GE公司;蛋白預(yù)染Marker 生工生物工程(上海)股份有限公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

AR UV2501 pC型紫外可見光光度計(jì) 日本島津公司;JXN-30/26型超高速冷凍離心機(jī) 美國貝克曼公司;超濾膜包(100 KD) 德國賽多利斯公司;高效液相色譜儀 美國安捷倫有限公司;蛋白純化儀 美國GE公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豬肺ACE粗提液的制備 參考吳瓊英等[7]的方法處理制備豬肺ACE粗提液。新鮮豬肺洗凈,剔除氣管、脂肪,切成小塊。稱取200 g豬肺,加入1 L含0.25 mol/L蔗糖的硼酸緩沖液(BBS,0.1 mol/L,pH8.3)進(jìn)行勻漿,勻漿液于4 ℃冰箱中浸提5 h。4 ℃條件下,8000 r/min離心40 min,得到勻漿上清液。往勻漿上清液中緩慢加入硫酸銨至終濃度為1.6 mol/L,于4 ℃冰箱中靜置4 h。4 ℃條件下,8000 r/min離心40 min,得到一級(jí)上清液。往一級(jí)上清液中繼續(xù)加入硫酸銨至終濃度為2.6 mol/L,4 ℃冰箱中靜置過夜。4 ℃條件下,8000 r/min離心40 min,得到二級(jí)沉淀,用0.1 mol/L硼酸緩沖液(BBS,pH8.3)復(fù)溶,裝入透析袋(截留分子量為(14000±2000) Da)中,加入同樣的緩沖溶液,在4 ℃條件下透析24 h,收集得到豬肺ACE粗提液。

1.2.2 DEAE離子交換層析放大實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 線性梯度洗脫 以周利琴等[11]的DEAE離子交換層析的純化工藝為基礎(chǔ),將層析柱體積放大至150 mL(放大15倍,柱直徑為2.5 cm),流速設(shè)定為2.5 mL/min。DEAE Sepharose FF 離子交換樹脂裝柱后,用0.1 mol/L BBS(pH8.3)平衡柱子,ACE粗提液(100 mg蛋白質(zhì))上樣后,再用0.1 mol/L BBS(pH8.3)洗滌至基線走平,然后用含0.21 mol/L NaCl和不含NaCl的BBS(0.1 mol/L,pH8.3)進(jìn)行梯度洗脫(梯度洗脫時(shí)間為2.5 h),收集洗脫峰,測(cè)定蛋白含量及ACE比活。

1.2.2.2 階梯式梯度洗脫 ACE粗提液(100 mg蛋白質(zhì))按照上述方法上樣,0.1 mol/L BBS(pH8.3)洗滌至基線走平后,用含0.12 mol/L NaCl的BBS(0.1 mol/L,pH8.3)洗脫柱子,時(shí)間為1.5 h,然后用含0.17 mol/L NaCl的BBS(0.1 mol/L,pH8.3)進(jìn)行洗脫,時(shí)間為1 h,收集每一步的洗脫峰,測(cè)定蛋白含量及ACE比活。

1.2.2.3 上樣量的選擇 分別考察上樣量為100和150 mg蛋白質(zhì)對(duì)分離效果的影響。ACE粗提液上樣后,用0.1 mol/L BBS(pH8.3)洗滌至基線走平,按照上述方法進(jìn)行階梯式梯度洗脫,收集目標(biāo)洗脫峰,測(cè)定蛋白含量及ACE比活。

1.2.3 超濾 采用超濾膜包(截留分子量為100 kDa)對(duì)DEAE洗脫液進(jìn)行超濾。100 mL DEAE洗脫液以5 mL/min的流速經(jīng)過膜包,然后用300 mL不含NaCl的0.1 mol/L BBS(pH8.3)洗滌,收集截留液,測(cè)定蛋白濃度及ACE比活。

1.2.4 蛋白含量測(cè)定 以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,采用紫外分光光度法測(cè)定蛋白濃度。稱取一定量的牛血清白蛋白溶于去離子水,配制成0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液,在280 nm處測(cè)定其吸光值。以牛血清白蛋白的濃度為橫坐標(biāo),以對(duì)應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)作圖,通過進(jìn)行線性擬合,得到蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=0.5855x+0.0031,R2=0.9999。

1.2.5 ACE活力測(cè)定 ACE水解馬脲酰-組氨酰-亮氨酸(HHL)生成馬尿酸(HA),可采用高效液相色譜法測(cè)定馬尿酸含量[12],計(jì)算其的生成速率,根據(jù)ACE每分鐘催化HHL生成1 μmol HA所需的酶量,從而得到ACE活力,其比活(U/mg)為1 mg蛋白質(zhì)所具有的酶活力。

1.2.6 ACE分子量及純度測(cè)定 采用不連續(xù)SDS-PAGE電泳對(duì)ACE的分子量及純度進(jìn)行測(cè)定。按照夏其昌[13]制備電泳膠(濃縮膠4.0%,分離膠7%)。取15 μL樣品,加入15 μL的樣品緩沖液,振蕩混合均勻,在沸騰的水中加熱3 min。樣品上樣體積為20 μL,電壓設(shè)置為100 V,樣品進(jìn)入分離膠后,電壓調(diào)節(jié)為150 V。當(dāng)樣品距離底部1 cm時(shí),結(jié)束電泳。關(guān)閉電源,取下凝膠膜,進(jìn)行染色、脫色并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,采用Origin 8.0 軟件作圖,采用SPSS 17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 DEAE離子交換層析放大工藝研究

2.1.1 線性梯度洗脫 在小試實(shí)驗(yàn)中[11],DEAE離子交換柱體積為10 mL,流動(dòng)相流速為1 mL/min,蛋白質(zhì)上樣量為10 mg。將層析柱放大15倍,流動(dòng)相的線速度保持不變,根據(jù)層析柱的直徑,確定流動(dòng)相的流速為2.5 mL/min,上樣量加大到100 mg。DEAE離子交換色譜圖如圖1所示。測(cè)定各收集組分的蛋白含量及ACE活力,結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在設(shè)定的條件下,樣品中的ACE全部吸附到DEAE離子交換樹脂上,分離效果良好,ACE主要集中在A4中。在周利琴[11]等的小試實(shí)驗(yàn)中,ACE粗提液經(jīng)DEAE純化,ACE比活提高到0.3953 U/mg,酶活回收率為16.79%。DEAE純化工藝放大后,ACE比活無顯著變化,為(0.365±0.03) U/mg,但是酶活回收率大大提高,為46.6%±0.4%。

圖1 DEAE離子交換色譜圖(線性梯度洗脫)Fig.1 DEAE ion exchange chromatogram(linear gradient elution)

2.1.2 階梯式梯度洗脫 在上述放大實(shí)驗(yàn)中,吸附的蛋白采用線性梯度洗脫,若進(jìn)行更大規(guī)模的純化,需要更大型的梯度混合儀,增大成本及實(shí)驗(yàn)操作難度。采用階梯梯度洗脫,可解決上述問題。根據(jù)圖1和表1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及線性梯度時(shí)間設(shè)置,計(jì)算目標(biāo)蛋白峰出峰時(shí)的NaCl濃度,設(shè)計(jì)階梯梯度洗脫實(shí)驗(yàn)。采用含0.12、0.17 mol/L NaCl的 BBS(0.1 mol/L,pH8.3)進(jìn)行階梯梯度洗脫,收集對(duì)應(yīng)的洗脫液B1和B2,結(jié)果如圖2和表2所示。

圖2 DEAE離子交換色譜圖(階梯梯度洗脫)Fig.2 DEAE ion exchange chromatogram(step gradient elution)

表2 DEAE離子交換純化表(階梯梯度洗脫)Table 2 Purification of pig ACE by DEAE ion exchange chromatography(step gradient elution)

由表2可知,采用階梯式梯度進(jìn)行洗脫,ACE可得到很好的分離,0.12 mol/L NaCl洗脫的都是雜蛋白,無ACE流出;0.17 mol/L NaCl可將ACE洗脫下來。與線性梯度洗脫相比,ACE比活和酶活回收率無明顯變化。因此,在DEAE離子交換層析放大工藝中,可采用階梯梯度洗脫的方式對(duì)豬肺ACE進(jìn)行洗脫,從而簡化實(shí)驗(yàn)操作。

2.1.3 上樣量的確定 在層析中,當(dāng)上樣量過少,樹脂得不到充分利用;上樣量過多,目標(biāo)蛋白會(huì)隨穿透液流出,造成樣品的浪費(fèi)。此外,不同的上樣量,會(huì)造成樹脂吸附能力發(fā)生變化,繼而影響洗脫的效果。本實(shí)驗(yàn)考察了上樣量蛋白量為100和150 mg對(duì)純化效果的影響,結(jié)果如表3所示。由表可見,加大樣品上樣蛋白量,更多的雜蛋白吸附到樹脂上,使得收集的洗脫液比活降低,不利于ACE的純化。通過綜合比較,選擇上樣蛋白量為100 mg。

表3 上樣量對(duì)DEAE離子交換層析純化的影響Table 3 The effect of loading quantities on the purification of DEAE ion exchange chromatography

2.2 超濾

采用超濾膜包(截留分子量為100 KD)對(duì)DEAE洗脫液進(jìn)行超濾處理,結(jié)果如表4所示。最終純化的ACE比活為(1.05±0.04) U/mg,酶活回收率為34.6%±0.3%,與小試實(shí)驗(yàn)相比,純化的ACE比活無明顯變化。

2.3 ACE純度及分子量測(cè)定

純化后的豬肺ACE的SDS-PAGE電泳圖如圖3所示。由圖3可知,豬肺ACE透析液經(jīng)DEAE離子交換和超濾,電泳圖顯示為一條條帶,達(dá)到電泳級(jí)純。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Marker的相對(duì)分子量的對(duì)數(shù)與相對(duì)遷移率的線性關(guān)系,計(jì)算得ACE相對(duì)分子量約為180 kD,與小試實(shí)驗(yàn)的純化結(jié)果一致。

圖3 豬肺ACE SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of pig lung ACE

目前,研究所用ACE大多依賴進(jìn)口,價(jià)格十分昂貴,主要原因就是ACE的純化周期長,成本高。DEAE離子交換層析-超濾法作為一種ACE的純化方法,具有生產(chǎn)成本低,工藝操作簡單,周期短,穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)。

由表5可知,在小試實(shí)驗(yàn)中,采用該方法可純化得到比活為1.25 U/mg的電泳級(jí)純ACE,酶活力回收率達(dá)12.28%。DEAE離子交換柱體積放大15倍后,上樣量擴(kuò)大10倍,洗脫液經(jīng)超濾后,最終得到的ACE比活為(1.05±0.04) U/mg,SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示為一條條帶,酶活回收率為34.6%±0.3%。由此可見,純化工藝放大后,所得的ACE比活、純度變化不大,酶活回收優(yōu)于小試實(shí)驗(yàn)結(jié)果,該工藝是可行的。此外,在放大實(shí)驗(yàn)中,采用階梯梯度方式進(jìn)行洗脫,與小試中的線性梯度洗脫相比,更適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

表5 豬肺ACE純化小試與放大工藝比較Table 5 Purification of pig lung ACE by small and scale-up process

3 結(jié)論

本研究在實(shí)驗(yàn)室水平成功采用DEAE離子交換層析-超濾法純化ACE的基礎(chǔ)上,對(duì)DEAE離子交換層析進(jìn)行了放大研究。DEAE離子交換柱體積放大到150 mL,流速為2.5 mL/min,上樣蛋白量為100 mg,采用0.12 mol/L NaCl和0.17 mol/L NaCl進(jìn)行階梯梯度洗脫,0.17 mol/L NaCl 洗脫液在流速為5 mL/min條件下超濾,獲得的ACE比活及純度與小試實(shí)驗(yàn)結(jié)果無明顯差異。研究結(jié)果表明,將實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的ACE純化小試工藝進(jìn)行放大是可行的,甚至可以得到更高的酶活回收率,為后續(xù)放大到更大規(guī)

模的工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考。