呂美云

(宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院,江西宜春 336000)

目前,蛋白酶已廣泛應(yīng)用于食品、藥品、洗滌劑及皮革等諸多工業(yè)領(lǐng)域[1]。而酶作為一類生物活性大分子具不穩(wěn)定性,尤其在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和高滲等極端條件下更容易失活,限制了酶在工業(yè)上的應(yīng)用[2]。高溫蛋白酶中的嗜熱蛋白酶具有對(duì)高溫、酸堿、有機(jī)溶劑、蛋白變性劑較穩(wěn)定且有良好抗性,因此,高溫蛋白酶的研究和應(yīng)用備受關(guān)注[3]。一般認(rèn)為蛋白酶的熱穩(wěn)定性與產(chǎn)酶菌株的生長(zhǎng)溫度相關(guān),產(chǎn)蛋白酶嗜熱菌株可從溫泉、火山口、深海熱泉等高溫環(huán)境獲得[4]。自1962 年對(duì)嗜熱菌蛋白酶報(bào)道以來[5],相繼從各地溫泉環(huán)境中篩選產(chǎn)蛋白酶嗜熱菌,以獲得熱穩(wěn)定性較高的高溫蛋白酶。祝偉等[6]從騰沖熱海溫泉樣品中分離的1株高溫產(chǎn)蛋白酶菌株YMTC 1049,其生長(zhǎng)溫度范圍為50～80 ℃。舒丹等[7]從西藏的尼木卡如林溫泉附近的土樣中分離出一株嗜熱堿性蛋白酶產(chǎn)生菌SD-142,其最適反應(yīng)溫度為 60 ℃,最適pH為9.5,具有良好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。張?jiān)品宓萚8]從溫泉中分離出一株產(chǎn)嗜熱蛋白酶芽孢桿菌DPE7,當(dāng)溫度為65 ℃,pH為9.0是最適宜的產(chǎn)酶條件。李楊霞等[9]從我國(guó)西南地區(qū)分別采取熱泉和地下熱水水樣,分離得到47株中度嗜熱菌,這些菌株在67或70 ℃時(shí),可分泌多種耐熱的水解酶,其中 38%的菌株分泌蛋白酶。廉立慧[10]從徂徠山溫泉附近土樣中獲得產(chǎn)高溫蛋白酶菌株L7,其最適溫度為 55 ℃,最適pH10,并且具有良好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。

宜春溫泉是國(guó)內(nèi)罕見的富硒少硫的溫泉,位于江西省宜春市溫湯鎮(zhèn),長(zhǎng)年水溫達(dá)68 ℃,目前對(duì)其蛋白酶生產(chǎn)菌的資源研究與應(yīng)用鮮有報(bào)導(dǎo)。本文以宜春溫泉溫湯古井水樣為樣品,用脫脂牛奶蛋白平板,55 ℃高溫培養(yǎng)的方法,篩選出產(chǎn)蛋白酶嗜熱菌株,并對(duì)其形態(tài)進(jìn)行觀察、生理生化鑒定和生長(zhǎng)特性的研究,以及菌株16S rRNA基因序列的分析,探究其種屬和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,以期豐富產(chǎn)蛋白酶嗜熱菌資源,為產(chǎn)蛋白酶嗜熱菌的后繼研究和高溫蛋白酶的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)樣品 采自江西宜春溫湯古井水樣(溫度68 ℃,pH6.5～6.7),4 ℃保存;培養(yǎng)基 種子液培養(yǎng)基:牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、NaCl 0.5%,pH7.2,121 ℃高溫滅菌30 min,斜面培養(yǎng)基加2%瓊脂;富集培養(yǎng)基:TYE 培養(yǎng)基[11];篩選培養(yǎng)基:TYE 培養(yǎng)基+底物(脫脂奶粉 黑龍江省完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司);Ezup柱式細(xì)菌基因組提取試劑盒、即用PCR試劑盒 上海生工生物工程有限公司。

DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠;50BS-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;SW-CT-2D型雙人單面超凈工作臺(tái) 蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司;T100 Bio-Rad伯樂 PCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司;BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像分析系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)蛋白酶嗜熱菌的篩選 用無菌過濾器濾過實(shí)驗(yàn)水樣,將過濾的濾紙直接加入富集培養(yǎng)基,55 ℃搖床培養(yǎng)24 h。再將富集培養(yǎng)液稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-55個(gè)梯度,選擇10-3、10-4、10-5三個(gè)梯度,取100 μL涂布于脫脂牛奶培養(yǎng)基上,每個(gè)梯度3個(gè)平行,置于55 ℃培養(yǎng)48 h。觀察菌落形狀、大小以及是否產(chǎn)透明圈。以不同菌落特征和有透明圈的菌株作為目標(biāo)菌株進(jìn)一步劃線分離。經(jīng)過3次劃線分離純化單菌株,4 ℃保藏于斜面。測(cè)量不同菌株的透明圈直徑(D)和菌落直徑(d),根據(jù)D/d值作為菌株產(chǎn)蛋白酶能力強(qiáng)弱的初步判斷。

1.2.2 產(chǎn)蛋白酶嗜熱菌的生長(zhǎng)特性的研究

1.2.2.1 菌體生長(zhǎng)的最適溫度 將23株菌種按3%接種量接種于液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)溫度設(shè)置為25、35、45、55、65 ℃,150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)48 h,測(cè)其OD600值,得出最適溫度。

1.2.2.2 菌體生長(zhǎng)的最適pH 將液體培養(yǎng)基初始pH調(diào)至5、6、7、8、9,把23株菌種按3%接種量接種于液體培養(yǎng)基中,55 ℃,150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)48 h,而后測(cè)其OD600值,得出最適pH。

1.2.3 產(chǎn)蛋白酶嗜熱菌株形態(tài)觀察和部分菌株生理生化鑒定

1.2.3.1 形態(tài)觀察 對(duì)純化的菌株進(jìn)行形態(tài)觀察記錄和革蘭氏染色,鏡檢觀察。

1.2.3.2 生理生化鑒定 根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[12]對(duì)代表菌株進(jìn)行生理生化鑒定,主要包括接觸酶、海藻酸鈉降解、硝酸鹽還原、甲基紅(M-R實(shí)驗(yàn))、V-P、檸檬酸鹽利用、酪素水解、淀粉水解、糖醇發(fā)酵(葡萄糖、乳糖、D-木糖、D-果糖、D-甘露糖、麥芽糖、L(+)-阿拉伯糖)、硫化氫、耐鹽(氯化鈉的梯度分別為2%、5%、7%、10%)、吲哚和Tween80降解實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 產(chǎn)蛋白酶嗜熱菌株的16S rRNA基因分子鑒定 用Ezup柱式細(xì)菌基因組提取試劑盒提取23株產(chǎn)蛋白酶嗜熱菌株DNA(具體方法見試劑盒使用說明書)。以總DNA為模板,采用文獻(xiàn)[13]中的細(xì)菌16S rDNA通用引物和50 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性1 min;56 ℃退火溫度,復(fù)性45 s;72 ℃延伸1.5 min;共30個(gè)循環(huán);最終72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在電壓95 V,1.0%瓊脂糖凝膠下電泳。凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)PCR 擴(kuò)增結(jié)果,送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序并拼接的菌株16SrRNA基因序列提交GenBank中進(jìn)行BLAS對(duì)比,利用MEGA6.0 中鄰接法(Neighbour-joining methods,NJ)構(gòu)建進(jìn)化樹,進(jìn)化樹分支置信度采用Bootstrap法(支重復(fù)次數(shù)為1000)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

三次測(cè)定數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)蛋白酶嗜熱菌的篩選與特征

通過富集和篩選,以產(chǎn)蛋白酶菌株在脫脂牛奶培養(yǎng)基可產(chǎn)生透明圈為依據(jù),從宜春溫泉溫湯古井水樣中篩選到29株產(chǎn)蛋白酶菌株,編號(hào)為:N1～N29,根據(jù)D/d比值越大產(chǎn)蛋白酶能力越強(qiáng),選取D/d值>1.0的23株產(chǎn)蛋白酶嗜熱菌菌株進(jìn)行菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色和生長(zhǎng)特性的研究,結(jié)果見表1。從表1中可見,大多數(shù)菌株的菌落特征呈現(xiàn)為濕潤(rùn)、乳白、橢圓,均為革蘭氏染色陽(yáng)性菌,在培養(yǎng)20 h內(nèi)多數(shù)沒有產(chǎn)芽孢。這23株菌生長(zhǎng)pH范圍為pH5.0～9.0,生長(zhǎng)的溫度范圍較廣,為25～65 ℃,除N27外,其余菌株最適生長(zhǎng)溫度為45～55 ℃,18株菌最高生長(zhǎng)溫度在55～65 ℃,其中N2、N4、N10、N18、N19、N20在65 ℃能明顯生長(zhǎng),視為兼性嗜熱菌[14]。

表1 產(chǎn)蛋白酶嗜熱菌的篩選結(jié)果與特征Table 1 Screening results and characteristics of producing-protease thermophiles

2.2 生理生化特征

選取N2、N5、N9、N11、N17、N20為代表菌株進(jìn)行生理生化鑒定,結(jié)果如表2所示,這6株代表菌株均不產(chǎn)氣,對(duì)海藻酸鈉實(shí)驗(yàn)、M-R實(shí)驗(yàn)、乳糖產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、Tween80 降解實(shí)驗(yàn)均為陰性,接觸酶、葡萄糖產(chǎn)酸為陽(yáng)性,可水解酪蛋白和淀粉(除N20不水解淀粉外),其余各項(xiàng)6株菌結(jié)果有差異,詳見表2。

表2 部分產(chǎn)蛋白酶嗜熱菌的生理生化結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical results of the representative strains

2.3 16S rRNA的基因序列與系統(tǒng)發(fā)育分析

23株產(chǎn)蛋白酶嗜熱菌菌株,經(jīng)過總DNA提取、PCR擴(kuò)增,結(jié)果見圖1。由見圖1可見均獲得約1500 bp大小的目的片段,經(jīng)雙向測(cè)序并拼接后,將各序列提交到NCBI上的GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù),獲得登錄號(hào):KY433860-KY433881,經(jīng)Blast比對(duì),獲得23株產(chǎn)蛋白酶嗜熱菌菌株近緣種相似種屬(見表3)。

圖1 23株菌株16S rRNA基因的PCR電泳結(jié)果Fig.1 PCR results of 16S rRNA genes PCR amplified of 23 strains注:M為DL2000標(biāo)準(zhǔn)品;1～23泳道依次為 N2、3、4、5、8、9、10、11、13、14、15、17、 18、19、20、22、23、24、25、26、27、28、29菌株。

表3 23株菌株的同源性分析Table 3 Homology analysis of 23 strains

用MEGA6.0 中鄰接法(Neighbour-joining methods,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖3,由Blast比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹可知23株產(chǎn)蛋白酶菌株可分別屬于厭氧芽孢桿菌(Anoxybacillus)、硫胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibacillus)、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)和芽孢桿菌屬(Bacillus)四個(gè)屬。N5、N27與Bacilluslicheniformis(CP014842.1)聚為一支,且與Bacilluslicheniformis同源性為99%,結(jié)合N5生理生化特征,可初步鑒定N5、N27為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)。4株短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)中,N11雖另聚為一支,但在生理生化上與N17基本一致,且N4、N11、N14、N17與Brevibacillusborstelensis同源性很高,均100%,初步認(rèn)為這4株菌為Brevibacillusborstelensis。厭氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillus)7株菌株與Anoxybacillusrupiensis同源性為99%,N9、N13、N18、N19、N28和Anoxybacillusrupiensis聚為一支,可以認(rèn)為同一種,而N2、N12則與Anoxybacillusamylolyticus聚為一支,初步鑒定為Anoxybacillussp,其余10株與Aneurinibacillusthermoaerophilus同源性為99%,(除N8外)均與Aneurinibacillusthermoaerophilus聚為一支,可初步鑒定為嗜熱氣硫胺素芽孢桿菌(Aneurinibacillusthermoaerophilus),占全部篩選菌株總數(shù)的39.1%。N8與N11聚集為一支,其分類單元有待于進(jìn)一步研究。

圖2 基于16SrRNA基因序列的產(chǎn)蛋白酶嗜熱菌菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the Producing-protease thermophile based on 16S rRNA gene sequence

3 結(jié)論與討論

本文從富硒溫泉水樣中篩選到23株產(chǎn)蛋白酶嗜熱菌,這23株菌菌株生長(zhǎng)pH范圍為5.0～9.0,生長(zhǎng)的溫度范圍較廣,為25～65 ℃,除N27外,其余菌株最適生長(zhǎng)溫度為45～55 ℃,18株菌最高生長(zhǎng)溫度在55～65 ℃,其中N2、N4、N10、N18、N19、N20在65 ℃能明顯生長(zhǎng),可視為兼性嗜熱菌。通過生理生化和16S rRNA基因序列分析,結(jié)果表明,這些菌株分別屬于厭氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillus)、硫胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibacillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)4個(gè)屬。其中2株(N5、N27)為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)。4株(N4、N11、N14、N17)為Brevibacillusborstelensis。7株厭氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillus)菌株中,N9、N13、N18、N19、N28初步鑒定為Anoxybacillusrupiensis,而N2、N12初步鑒定為Anoxybacillussp,剩余的10株(除N8外)均嗜熱氣硫胺素芽孢桿菌(Aneurinibacillusthermoaerophilus),占全部分離菌株總數(shù)的39.1%,為宜春富硒溫泉水樣中產(chǎn)蛋白酶嗜熱菌的優(yōu)勢(shì)菌群。N8分類單元有待于進(jìn)一步研究。

產(chǎn)蛋白酶嗜熱菌株多見于芽孢桿菌屬(Bacillus),已報(bào)導(dǎo)的有芽孢桿菌(Bacillussp. DPE_7)[8]、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)[15]、嗜熱芽孢桿菌(ThermophilicBacillus)[16]、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)[17],莫海威芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)[18]等,本文2株地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)為產(chǎn)蛋白酶嗜熱菌株,這與劉喚明[19]報(bào)導(dǎo)的一致。

目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的高溫產(chǎn)蛋白酶的菌株中,短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)報(bào)道也不多,廉立慧[9]從徂徠山溫泉附近土樣中分離到一株產(chǎn)嗜熱蛋白酶的菌株L7,首次報(bào)道該菌株為Brevibacillus屬。龔志婷[20]報(bào)道騰沖溫泉產(chǎn)蛋白酶的菌株主要分布在Geobacillus、Brevibacillus及Aneburinibacillus三屬。本研究中篩選到4株Brevibacillus和9株Aneurinibacillus二屬,未見Geobacillus屬的產(chǎn)蛋白酶的嗜熱菌株。而本文還獲得7株Anoxybacillus屬的菌株,Anoxybacillussp.在2000年作為新的種屬首次報(bào)道[21],近年來,在我國(guó)云南騰沖溫泉土壤中相繼篩選到厭氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillus)產(chǎn)耐熱普魯蘭酶菌株Anoxybacillussp.LM 18-11[22]和產(chǎn)ɑ-淀粉酶的菌株Anoxybacillussp.GXS-3[23],國(guó)內(nèi)還未見有溫泉環(huán)境中厭氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillus)產(chǎn)蛋白酶嗜熱菌的報(bào)道,可見宜春富硒溫泉有著豐富的產(chǎn)蛋白酶嗜熱菌資源,為高溫蛋白酶的開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。