陳建平,龐藝萌,劉 穎,劉 海,鐘賽意,諶素華,秦小明,*

(1.廣東海洋大學食品科技學院,廣東省亞熱帶果蔬加工現代農業(yè)科技創(chuàng)新中心,廣東湛江 524088;2.廣東省天然產物綠色加工與產品安全重點實驗室,廣東廣州 510640;3.廣東海洋大學農學院,廣東湛江 524088)

姜黃素(Curcumin)是一種從姜黃根莖中提取出來的黃酮類化合物[1]。作為一種天然的食用色素,姜黃素是世界衛(wèi)生組織和美國食品藥品管理局以及多國準許使用的食品添加劑[2]。近年來,大量的臨床研究表明,姜黃素具有抗腫瘤[3-4]、抗氧化[5-6]、抗炎[7-8]、清除自由基、抗衰老等諸多功效。然而,由于姜黃色素難溶于水,不便于注射給藥,所以目前姜黃素的動物學實驗研究以至臨床實驗研究多采用口服給藥的方法。這一難溶性特點極大地限制了它在食品和醫(yī)藥中的應用價值。

β-環(huán)糊精(β-cyclodextrin)是由7個葡萄糖分子以α-1,4糖苷鍵連接而成的環(huán)狀低聚糖化合物,是一種良好的包合材料[9-10]。研究表明,β-環(huán)糊精與姜黃素形成的包合物能有效誘導白血病細胞凋亡[11]。而且,Yallapu 等[12]也發(fā)現,相比單獨的姜黃素,β-環(huán)糊精與姜黃素形成的包合物具有更好的抗腫瘤效果。然而,考慮到如果直接采用環(huán)糊精作為藥物載體,存在其自身水溶性低的問題,因此,課題組前期應用超分子化學的理論,采用聚合反應把環(huán)糊精合成為具有水溶性良好的環(huán)糊精聚合物作為藥物載體成功制備了姜黃素超分子包合物。目前國內外還未見有關姜黃素超分子包合物的抗腫瘤活性評價的報道。因此,為了對姜黃素超分子包合物的抗腫瘤活性進行評價,本文采用CCK8比色法檢測姜黃素超分子包合物對A375黑色素瘤細胞、A549肺癌細胞、Hela宮頸癌細胞和MCF-7乳腺癌細胞四種腫瘤細胞生長的影響,并進一步運用Annexin-V/PI雙染檢測姜黃素超分子包合物抑制腫瘤細胞增殖的原因。該研究結果為姜黃素超分子包合物在抗腫瘤領域的應用提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

姜黃素超分子包合物 實驗室自制[13];胎牛血清、青霉素、鏈霉素 美國Gibco公司;RPMI-1640 美國Hyclone公司;Trysin-EDTA溶液 美國GENVIEW公司;Cell Counting Kit-8(CCK-8) Dojindo公司;Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒 聯(lián)科生物公司;96孔板細胞培養(yǎng)板 美國NEST公司;人黑色素瘤細胞A375、人肺癌細胞A549、人宮頸癌細胞Hela、人乳腺癌細胞MCF-7 美國ATCC公司。

BP301S電子天平 德國Sartorius公司;TDL-80-2B低速離心機 上海安亭科學儀器廠;INC108 CO2細胞培養(yǎng)箱 德國Memmer公司;Multiscan MK3酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀 美國Thermo Fisher Scientific公司;FACSCalibur流式細胞儀 美國BD公司;倒置熒光顯微鏡 MOTIC公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 姜黃素超分子包合物的制備 參照陳建平[13]等的方法進行制備。稱取15.76 g NaOH于三口燒瓶中,加32 mL H2O,攪拌溶解。再稱取20 gβ-環(huán)糊精,加入三口燒瓶,攪拌全溶至澄清,在30 ℃下緩慢加入環(huán)氧氯丙烷(EPC)9.64 mL,攪拌24 h,冷卻至室溫。將反應液倒入錐形瓶中,超聲5 min。將溶液倒入透析袋中(先用水潤濕清洗,再用蒸餾水洗滌兩次),放入盛有蒸煙水的大燒杯屮透析,開始時每小時換一次蒸餾水,之后延長時間更換水,透析至中性。將透析袋中溶液抽濾,濾去不溶物,然后用0.45 μm的纖維素膜過濾,過濾后進行旋蒸,蒸至粘稠狀,加入無水乙醇析出白色固體,過濾,真空干燥,得環(huán)糊精聚合物。將姜黃素和環(huán)糊精聚合物按質量比1∶4混勻,加入研缽中研磨,研磨均勻后倒入錐形瓶中,加入50 mL水,超聲5 min,功率120 W。將錐形瓶放磁力攪拌器上攪拌2 d后,將包合物溶液抽濾,除去未溶解的姜黃素,再將溶液進行旋蒸,真空干燥,即得水溶性姜黃素超分子包合物。

1.2.2 姜黃素超分子包合物的抗腫瘤活性測定

1.2.2.1 細胞培養(yǎng) 細胞復蘇后培養(yǎng)在含10%胎牛血清,100 U/mL青霉素和50 U/mL鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中。細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃,5% CO2)72 h后,根據細胞的生長狀態(tài)傳代,取對數生長期細胞用于以下CCK-8實驗。

1.2.2.2 CCK-8方法檢測細胞生長曲線 取對數生長期的細胞進行實驗,經細胞傳代后,調整細胞密度至1×105/mL。將四種腫瘤細胞(A375細胞、A549細胞、Hela細胞、MCF-7細胞)以每孔100 μL接種于 96 孔培養(yǎng)板,置于培養(yǎng)箱中(37 ℃,5% CO2)培養(yǎng) 24 h。往不同的96孔板中分別加入不同濃度的姜黃素超分子包合物(0、40、80、160、320、640 μg/mL)。經不同濃度的姜黃素超分子包合物處理的五種腫瘤細胞分別培養(yǎng) 24、48和72 h后。采用倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)變化。然后,往96孔細胞培養(yǎng)板中加入CCK-8,每孔10 μL,放入37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h 后,用酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm處測定各孔OD值,以空白對照組的OD值為100%,根據如下公式計算不同處理組中的細胞存活率[14]。每次實驗重復三次。

細胞存活率的計算公式如式(1):

細胞存活率(%)=Ai/A0×100

式(1)

其中,Ai表示不同處理組的OD值;A0表示空白對照組的OD值。

1.2.2.3 比較姜黃素超分子包合物對四種腫瘤細胞處理不同時間后的IC50值 以各個濃度的細胞存活率為縱坐標,相應濃度的對數值為橫坐標作散點圖,進行線性擬合,得出線性方程。將存活率為 50%代入到線性方程中,從而計算出細胞的半數抑制濃度(IC50)。

1.2.3 Annexin-V/PI雙染檢測A375細胞凋亡 參考Zhang等的方法進行[15]。取A375對數生長期的細胞進行實驗,經細胞傳代后,調整細胞密度。以1×105細胞/孔接種于6孔板,置于培養(yǎng)箱中(37 ℃,5% CO2)培養(yǎng)24 h后,加入不同濃度的姜黃素超分子包合物(0、80、160、320、640 μg/mL)孵育72 h,然后,用胰酶將細胞消化下來,在1000 r/min下離心5 min,經PBS洗2次,收集細胞。經500 μL預冷的1×Binding Buffer懸浮細胞后,加入5 μL Annexin V-FITC混勻,然后再加入10 μL碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)混勻,孵育15 min后,采用流式細胞儀在激發(fā)波長Ex=488 nm和發(fā)射波長Em=530 nm的條件下進行檢測。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 姜黃素超分子包合物對A375黑色素瘤細胞生長的影響

不同濃度的姜黃素超分子包合物對A375細胞作用處理時間的實驗結果見圖1所示。由圖1可知,當姜黃素超分子包合物處理A375細胞24 h后,隨著姜黃素超分子包合物濃度的升高,細胞存活率從103.5%±2.6%降低到94.9%±1.1%。當處理時間增加到72 h時,隨著姜黃素超分子包合物濃度的升高,細胞存活率從92.7%±0.9%降低到43.0%±1.2%。實驗結果表明,在實驗處理的時間和濃度范圍內,A375細胞存活率均隨姜黃素超分子包合物濃度的升高和處理時間的增加呈下降趨勢。這種趨勢的原因可能是由于姜黃素超分子包合物隨著處理時間和濃度的增加,包合物可能被細胞吸收,當細胞內吸收的包合物達到一定量后,包合物可能會調控細胞內某些蛋白質的表達變化,從而引起細胞發(fā)生凋亡。

圖1 不同濃度的姜黃素超分子包合物 對A375細胞處理不同時間后對其存活率的影響Fig.1 Effects of different concentration of curcumin/ β-cyclodextrin polymer inclusion complex on cell viability of A375 cells at different treatment times注:不同字母表示統(tǒng)計學上顯著性差異(p<0.05)，相同字母表示統(tǒng)計學上沒有顯著性差異;圖2～圖4同。

2.2 姜黃素超分子包合物對A549肺癌細胞生長的影響

不同濃度的姜黃素超分子包合物對A549細胞作用處理時間的實驗結果見圖2所示。由圖2可知,當姜黃素超分子包合物處理A549細胞24 h后,隨著姜黃素超分子包合物濃度的升高,細胞存活率從98.3%±2.2%降低到92.5%±2.3%。當處理時間增加到72 h時,隨著姜黃素超分子包合物濃度的升高,細胞存活率從95.5%±4.3%降低到44.5%±1.2%。實驗結果表明,在實驗處理的時間和濃度范圍內,A549細胞存活率均隨姜黃素超分子包合物濃度的升高和處理時間的增加呈下降趨勢。

圖2 不同濃度的姜黃素超分子包合物 對A549細胞作用處理時間后對其細胞存活率的影響。Fig.2 Effects of different concentration of curcumin/ β-cyclodextrin polymer inclusion complex on cell viability of A549 cells at different treatment times

2.3 姜黃素超分子包合物對Hela宮頸癌細胞生長的影響

不同濃度的姜黃素超分子包合物對Hela細胞作用處理時間的實驗結果見圖3所示。由圖3可知,當姜黃素超分子包合物處理Hela細胞24 h后,隨著姜黃素超分子包合物濃度的升高,細胞存活率從101.2%±2.1%降低到82.1%±2.1%。當處理時間增加到72 h時,隨著姜黃素超分子包合物濃度的升高,細胞存活率從89.9%±4.1%降低到50.1%±1.6%。實驗結果表明,在實驗處理的時間和濃度范圍內,Hela細胞存活率均隨姜黃素超分子包合物濃度的升高和處理時間的增加呈下降趨勢。

圖3 不同濃度的姜黃素超分子包合物 對Hela細胞處理不同時間后對其細胞存活率的影響。Fig.3 Effects of different concentration of curcumin/ β-cyclodextrin polymer inclusion complex on cell viability of Hela cells at different treatment times

2.4 姜黃素超分子包合物對MCF-7乳腺癌細胞生長的影響

不同濃度的姜黃素超分子包合物對MCF-7細胞處理不同時間的實驗結果見圖4所示。由圖4可知,當姜黃素超分子包合物處理MCF-7細胞24 h后,隨著姜黃素超分子包合物濃度的升高,細胞存活率從96.5%±5.0%降低到77.4%±2.5%。當處理時間增加到72 h時,隨著姜黃素超分子包合物濃度的升高,細胞存活率從95.7%±2.8%降低到59.4%±4.2%。實驗結果表明,在實驗處理的時間和濃度范圍內,MCF-7細胞存活率均隨姜黃素超分子包合物濃度的升高和處理時間的增加呈下降趨勢。

圖4 不同濃度的姜黃素超分子包合物 對MCF-7細胞處理不同時間后對其細胞存活率的影響。Fig.4 Effects of different concentration of curcumin/ β-cyclodextrin polymer inclusion complex on cell viability of MCF-7 cells at different treatment times

2.5 姜黃素超分子包合物對四種腫瘤細胞處理不同時間后的IC50比較

為了更直觀的比較姜黃素超分子包合物對這四種細胞的抗腫瘤活性作用,本文通過計算細胞的半數抑制濃度(IC50)來進行比較[16]。計算結果如表1所示。由表1可知,不同濃度的姜黃素超分子包合物(40～640 μg/mL)對A375細胞、A549細胞、Hela細胞和MCF-7細胞作用24 h后計算其IC50分別為2202.8、1830.8、1026.9和987.6 μg/mL,當處理時間增加到72 h后,發(fā)現其IC50分別下降到476.4、517.2、545.7和692.8 μg/mL,結果表明,隨著處理時間的增加,姜黃素超分子包合物對四種細胞的IC50均呈下降趨勢,且姜黃素超分子包合物對A375細胞處理72 h時,其IC50值達到最低為476.4 μg/mL,這表明姜黃素超分子包合物對A375細胞處理72 h時,抑制A375細胞增殖的能力最強。因此,本文選擇對A375細胞處理72 h進行后續(xù)的細胞凋亡機理初探。

表1 姜黃素超分子包合物 對不同細胞作用不同時間的 IC50 值Table 1 IC50 of different cells exposed to curcumin/ β-cyclodextrin polymer inclusion complex for different times

2.6 Annexin-V/PI雙染檢測A375細胞凋亡

在抑制腫瘤細胞增殖的過程中,誘導細胞周期阻滯和/或誘導細胞凋亡往往是目前被認為抑制細胞增殖的主要原因[17-18]。為了進一步闡明姜黃素超分子包合物抑制腫瘤細胞增殖的機理,本文選擇對姜黃素超分子包合物具有抑制作用最強的A375細胞作為研究對象,采用Annexin-V/PI 雙染檢測姜黃素超分子包合物對A375細胞的細胞凋亡情況。AnnexinV是一種與膜磷脂酰絲氨酸(PS)具有高度結合力的磷脂結合蛋白,而碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一種不能透過正常細胞細胞膜的核酸染料。當細胞發(fā)生凋亡時,在凋亡早期,PS會由脂膜的內側翻向外側與凋亡早期細胞的胞膜結合,而在凋亡的中晚期,細胞和死細胞的細胞膜通透性增加,PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅,因此將Annexin V與PI匹配使用,就可以將處于早期凋亡細胞、死細胞和晚期凋亡細胞區(qū)分開來[19-20]。Annexin-V/PI 雙染檢測A375細胞凋亡的實驗結果如圖5所示。由圖5可知,對照組中凋亡細胞數量為3.3%,當經80 μg/mL姜黃素超分子包合物處理A375細胞后,細胞凋亡數量從對照組的 3.3%上升到 20.7%。并且,當姜黃素超分子包合物的濃度提高到640 μg/mL時,其細胞凋亡總數從20.7%提高到35.0%。上述結果表明,姜黃素超分子包合物抑制A375細胞增殖主要是通過誘導細胞凋亡來實現的。

圖5 不同濃度的姜黃素超分子包合物對A375細胞凋亡數目的影響。Fig.5 Effects of different concentration of curcumin/β-cyclodextrin polymer inclusion complex on population of apoptotic A375 cells

3 結論

本文采用CCK8比色法檢測姜黃素超分子包合物對A375黑色素瘤細胞、A549肺癌細胞、Hela宮頸癌細胞和MCF-7乳腺癌細胞四種腫瘤細胞生長的影響。實驗結果表明,姜黃素超分子包合物抑制四種腫瘤細胞的增殖均呈濃度和時間依賴性。而且,姜黃素超分子包合物對A375黑色素瘤細胞的抑制活性最強(72 h后的抑制率達到了43.0%±1.2%),其次是A549肺癌細胞(72 h后的抑制率達到了44.5%±1.2%),而對MCF-7乳腺癌細胞的抑制活性最弱(72 h后的抑制率達到了59.4%±4.2%)。并且,通過比較姜黃素超分子包合物對四種腫瘤細胞作用的IC50值也發(fā)現姜黃素超分子包合物抑制A375細胞增殖的能力最強,其IC50達到最低為476.4 μg/mL。運用Annexin-V/PI 雙染進一步檢測姜黃素超分子包合物抑制A375細胞增殖的原因,發(fā)現,姜黃素超分子包合物抑制A375細胞增殖主要是通過誘導細胞凋亡來實現的。然而,對于姜黃素超分子包合物如何誘導A375細胞凋亡的相關機制還不清楚,有待于下一步的研究。