柏建山，趙尚志，張森，鄧艷，黃燕瓊，何淑華，戴金，石磊

（1.廣州機場出入境檢驗檢疫局國家水產品檢測重點實驗室，廣東廣州 510470）

（2.暨南大學食品安全與營養(yǎng)研究院，廣東廣州 510632）

異尖線蟲病是人感染異尖線蟲的第三期幼蟲引起的疾病，主要是由于食入生的或未熟的海魚，如壽司和生魚片等[1]。感染的異尖線蟲可以鉆入消化道，或移行到其它組織，從而引起人的急腹癥癥狀：如劇烈腹痛、惡心、嘔吐、腹瀉等[1～4]，還能導致人的過敏反應[5～7]。引起異尖線蟲病的蟲種有6種[8]，即簡單異尖線蟲、典型異尖線蟲、抹香鯨異尖線蟲、擬地新線蟲、對盲囊線蟲和宮脂線蟲。典型異尖是廣大熱帶及副熱帶地區(qū)的優(yōu)勢蟲種，嚴重威脅了人類的健康[3,4,9]，因此建立典型異尖線蟲快速準確的檢測方法至關重要。

異尖線蟲的傳統(tǒng)鑒別方法是利用其形態(tài)學特征，依據其頭端、消化道、尾部結構特征來判斷[10]。但各個蟲種間形態(tài)相似，在不同的生長階段，其形態(tài)、結構存在很大差異，單純的依靠形態(tài)學方法很難鑒定到種間差異。

近年來，利用分子生物學方法鑒定蟲種的方法得到發(fā)展，如PCR技術。但PCR技術耗時較長、需要在實驗室內進行檢測，這導致PCR技術很難在基層推廣；免疫學方法也因特異性較差而受到限制。

環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術是一種體外的基因擴增技術[11]。用4條特異性引物識別靶基因的6個區(qū)域，并加入兩條環(huán)引物加速反應，利用一種具有鏈置換功能的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒溫條件(60～65 ℃)反應 30～60 min，即可完成反應。本研究將LAMP技術與實時熒光技術相結合，利用實時熒光技術可以將LAMP反應可視化，進行實時監(jiān)控，根據擴增曲線判斷結果。與普通LAMP技術相比，反應時間更短，反應的靈敏度和特異性更高，操作更為簡便，成本更加低廉，適合在基層推廣應用。

本研究根據典型異尖線蟲 ITS2區(qū)域設計特異性引物[12]，建立了典型異尖線蟲的恒溫實時熒光快速檢測方法，并且進行了靈敏度、特異性和穩(wěn)定性驗證。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 蟲體來源

典型異尖線蟲由廣州機場檢驗檢疫局國家水產品檢測重點實驗室在2015～2016年進境海魚體中分離鑒定并保存。對比蟲體簡單異尖線蟲(A. simplex)、短棘異尖線蟲(A.brevispiculata)、抹香鯨異尖線蟲(A.physeteris)、Anisakis nascettii、宮脂線蟲（Hysterothylacium Spp.）、對盲囊線蟲（Contracaccum Spp.）、顎口線蟲(Gnathostoma spp.)均由上述實驗室分離鑒定并保存。

1.1.2 主要試劑

Bst DNA polymerase large fragment，美國 New England Biolabs公司；甜菜堿(Betaine)、MgCl2，美國Sigma公司；SYBR Green Ⅰ熒光染料，Life Technologies公司；引物，上海英濰捷基貿易有限公司；DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、18-T載體克隆試劑盒、DH5α菌株、質粒提取試劑盒、Tap酶、Mg2+、dNTPs、PCR10×Buffer反應液均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蟲體基因組

DNA提取，將蟲體從保存液中取出，置于1.5 mL離心管中，用蒸餾水反復浸泡清洗3次，每隔2 h換水1次，使用Takara公司的Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒，按照說明書步驟提取異尖線蟲基因組DNA，微量紫外分光光度計檢測基因組DNA的濃度，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設計與合成

GenBank中獲得典型異尖線蟲 ITS2(AY826724)序列，根據ITS2的保守區(qū)，利用在線設計軟件Primer Explorer version4(http://primerexplorer.jp/e)進行LAMP引物設計，共設計3套引物，將設計好的引物序列在NCBI網站進行序列特異性比對。Oligo 7.0對引物之間的二聚體、發(fā)夾結構、錯配等情況進行分析，引物由上海英濰捷基貿易有限公司合成。根據引物篩選試驗結果，選取最優(yōu)引物，最終使用的引物為第二套引物（見表1）。

表1 恒溫實時熒光法引物序列Table 1 Sequence of primers for the real-time LAMP

1.2.3 質粒構建

用LAMP引物的外引物F3、B3對典型異尖線蟲基因組 DNA進行 PCR擴增，使用 Takara公司的Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒，按照說明書步驟進行DNA片段的回收，使用Takara公司的pMDTM 18-T Vector Cloning Kit試劑盒，按照說明書步驟進行質粒構建，使用 Takara公司的 Plasmid Purification Kit Ver.4.0試劑盒，按照說明書步驟進行質粒的提取。用NanoDrop2000微量紫外分光光度計檢測質粒DNA的濃度，將質粒置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.4 恒溫實時熒光法反應體系的建立

本研究采用 25 μL反應體系，8 mM dNTP、10×ThermoPol反應緩沖液、120 mM MgSO4水溶液、F3 0.2 μM、B3 0.2 μM、FIP 1.6 μM、BIP 1.6 μM、LF 0.8 μM、LB 0.8 μM、DNA聚合酶8 U、10×SYBR Green I 0.5 μL、待檢樣品2 μL，用超純水補齊到25 μL，最后在體系表面加密封油防止污染，將配制好的反應管混勻后離心，以典型異尖線蟲DNA為陽性對照，超純水為陰性對照，于LAMP恒溫擴增檢測儀（廣州雙螺旋基因技術有限公司）中63 ℃反應45 min。

結果判讀方法：若有“S”型擴增曲線，則判斷為陽性，若無“S”型擴增曲線，則判斷為陰性。

1.2.5 特異性試驗

用建立的恒溫實時熒光法對其它寄生蟲簡單異尖線蟲（A. simplex）、短棘異尖線蟲（A. brevispiculata）、抹香鯨異尖線蟲（A. physeteris）、anisakis nascettii、宮脂線蟲（Hysterothylacium Spp.）、對盲囊線蟲（Contracaccum Spp.）、顎口線蟲（Ggnathostoma spp.）的DNA進行擴增。

1.2.6 靈敏度試驗

將含目的基因片段的質粒DNA以10倍的梯度稀釋到 1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL、100 ag/μL、10 ag/μL，取 10 pg/μL～10 ag/μL濃度的模板進行恒溫實時熒光法擴增。

1.2.7 與PCR方法比較

用外引物 F3、B3作為 PCR 引物對 10 pg/μL～1 fg/μL質粒模板進行PCR擴增，體系為25 μL：2.5 μL 10×PCR buffer，2 mM Mg2+，0.8 mM dNTPs，0.4 μM F3 引物，0.4 μM B3引物，1.25 U Taq酶(Takara)，2 μL DNA模板，用超純水補齊至25 μL。反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性45 s、60 ℃退火延伸1 min，40個循環(huán)。反應產物在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳20 min。

1.2.8 實際樣品的檢測

對廣州機場檢驗檢疫局國家水產品檢測重點實驗室在2015年至2016年，5批次來自熱帶地區(qū)海魚體內檢出的異尖線蟲進行檢測，共選取41條蟲體進行恒溫實時熒光法檢測，并與 PCR檢測方法進行比較。PCR檢測方法依據中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準 SC/T 7210-2011，使用上游引物 390（5’-ATCCGTGTTTCAAGACGGG-3’）和下游引物391（5’-AGCGGAGGAAAAGAAACTAA-3’）對蟲體DNA進行擴增，反應體系參照1.1.5，反應程序為：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。反應產物大小為800 bp左右，送測序公司測序，將測序結果在NCBI網站上進行序列比對。

2 結果與討論

2.1 恒溫實時熒光法反應條件的確定

圖1 恒溫實時熒光法引物反應效率的檢測Fig.1 Detection of the reaction efficiency of the real-time LAMP primers

用3套特異性引物對典型異尖線蟲DNA進行恒溫實時熒光法擴增，篩選出最優(yōu)的特異性引物。結果顯示，3套引物均能擴增，而第二套引物擴增曲線最標準，出峰時間最短（見圖1），所以選取第二套引物作為本研究的特異性引物。

2.2 特異性試驗

圖2 典型異尖線蟲恒溫實時熒光法特異性試驗Fig.2 Assessment of specificity of the real-time LAMP assay for A.typica

特異性試驗表明，對于短棘異尖線蟲（A.brevispiculata）、抹香鯨異尖線蟲（A. physeteris）、典型異尖線蟲（A. typica）、anisakis nascettii、宮脂線蟲（Hysterothylacium spp.）、對盲囊線蟲（Contracaccumspp.）、顎口線蟲（Ggnathostoma spp.）的DNA模板，未產生“S”型擴增曲線，說明沒有目的片段擴增，對于典型異尖線蟲DNA模板，產生“S”型擴增曲線，說明目的片段能夠擴增（見圖2），表明建立的典型異尖線蟲的恒溫實時熒光檢測方法具有嚴格的特異性。

2.3 靈敏度試驗

圖3 典型異尖線蟲恒溫實時熒光法的靈敏度試驗Fig.3 Assessment of sensitivity of the real-time LAMP for A.typica

圖4 典型異尖線蟲恒溫實時熒光法與PCR方法的比較Fig.4 Comprision of the real-time LAMP for A.typica and theconventional PCR

含目的基因片段的質粒濃度為29 ng/μL，將其稀釋到 1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL、100 ag/μL、10 ag/μL，選取 10 pg/μL～10 ag/μL質粒模板進行恒溫實時熒光法擴增，其檢測限為1 fg/μL（見圖3）。用PCR方法對相同濃度的質粒模板進行擴增，其檢測限為100 fg/μL（見圖4），恒溫實時熒光法的靈敏度比PCR方法高出兩個數(shù)量級。表明建立的典型異尖線蟲恒溫實時熒光檢測方法具有很高的靈敏度。

2.4 重復性和穩(wěn)定性試驗

圖5 典型異尖線蟲恒溫實時熒光法的穩(wěn)定性試驗Fig.5 Assessment of stability of the real-time LAMP for A.typica

用恒溫實時熒光法對最低檢測限1 fg/μL的質粒模板進行15次重復試驗，驗證本研究的穩(wěn)定性和重復性。對1 fg/μL質粒模板的15次平行試驗，均產生“S”型擴增曲線，說明全部擴增，且出峰時間相差不大，擴增曲線標準，重復性良好，陰性對照無擴增，假陽性率為0（見圖5）。表明建立的典型異尖線蟲的恒溫實時熒光檢測方法具有良好的重復性和穩(wěn)定性。

2.5 實際樣品的檢測

用恒溫實時熒光法對5批次來自熱帶地區(qū)的進境實際樣品進行檢測，并與PCR檢測方法進行比較。恒溫實時熒光法檢測結果與PCR檢測結果完全一致，假陽性率為0（見表2）。說明本研究建立的LAMP檢測方法適用于典型異尖線蟲實際樣本的檢測。

表2 實際樣品中恒溫實時熒光法和PCR方法檢測典型異尖線蟲的結果Table 2 Detection results for detrction A.typica by real-time LAMP method and PCR method in samples

3 結論

3.1 自1960年van Thiel在荷蘭發(fā)現(xiàn)并報道了異尖線蟲病例后，國際上感染并報道的異尖線蟲病例越來越多。至今，全世界已有超過3萬異尖線蟲病例，所以異尖線蟲日益受到各界的重視，我國已將異尖線蟲列為二類禁止入境的寄生蟲。我國在2013年報道了首例異尖線蟲病病例[13]，隨著人口流動、文化傳播以及國際貿易的全球化，特別是人們生食魚肉變得越來越普遍，異尖線蟲病的發(fā)生率也在不斷增加，由異尖線蟲或其過敏物質引起的過敏反應也在不斷增加[14]。在所有的致病種中，典型異尖線蟲廣泛存在于熱帶及副熱帶地區(qū)，是很多海域的優(yōu)勢蟲種[3,4,9,15,16]，廣州機場出入境檢驗檢疫局國家水產品檢測重點實驗室對來自孟加拉、越南和澳大利亞等國家的海魚進行檢測，發(fā)現(xiàn)了大量的典型異尖線蟲，并且肌肉中的感染率很高，嚴重威脅了人類的健康。

3.2 為了能夠更好的檢測典型異尖線蟲，有效控制其傳播和感染，快速、靈敏和準確的檢測方法是必不可少的。LAMP方法已經應用于檢測食源性病原的多個領域，如：細菌、病毒、真菌、原蟲[17,18]，但在蠕蟲檢測上的應用還很少，影響了蠕蟲病病原檢測技術的發(fā)展。以往，LAMP檢測方法的結果判定有凝膠電泳法、顯色法、濁度法。凝膠電泳法需要開蓋才能完成，可能產生氣溶膠污染，而造成假陽性；顯色法是最經濟的方法，不需要在反應過程中收集信號，只需恒溫水浴鍋即可完成反應，但顯色法需要反應結束后開蓋加入顯色液，也容易造成擴增產物的氣溶膠污染；濁度法包括焦磷酸鎂沉淀觀察法和實時濁度法，不需要添加額外的試劑，不需要開蓋，但焦磷酸鎂沉淀觀察法存在人為判斷的主觀性，實時濁度法也因渾濁顆粒不均一和反應液存在不透明顆粒等因素導致較低的靈敏度。為了克服上述方法的不足，恒溫實時熒光法不斷被發(fā)開并應用于實際的樣品檢測中，它是一種新型的可視化方法，將LAMP技術與實時熒光檢測技術有機的結合，可以對擴增過程進行及時判讀，在保證高敏感性的同時，使檢測結果數(shù)據化、形象化，不同于終點判讀方法，可以在反應過程中對出峰時間、擴增曲線以及擴增效率進行實時監(jiān)控，使反應時間更短，在一定程度上避免了假陽性的存在。

3.3 本研究根據典型異尖線蟲的ITS2特異性基因，建立了典型異尖線蟲的恒溫實時熒光檢測法，該方法具有靈敏度高、特異性好、方便和快速等優(yōu)點，靈敏度可達1 fg/μL，反應時間短，45 min內便可完成反應，而傳統(tǒng)的PCR方法至少需要2～3 h。在澳大利亞等國家進境水產品中應用該方法進行檢測，結果表明該檢測方法具有廣泛的實用性和良好的應用前景，特別適合于在基層和各進行推廣和應用。