陳沛，劉會(huì)平，孫娜新，劉子天，李委紅，劉旭輝，劉少娟

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

灰樹花（Grifola frondosa），學(xué)名為“貝葉多孔菌”，俗稱“舞菇”[1]，是一種珍貴的食、藥兼用真菌，夏、秋間常野生于栗樹周圍?；覙浠▽儆趽?dān)子菌亞門、多孔菌科、樹花菌屬，也是世界上最主要的食用菌之一[2]?；覙浠ú粌H口感鮮美，含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素、多種微量元素，更具免疫活性和抗癌作用[3,4]。據(jù)報(bào)道，現(xiàn)已從灰樹花的子實(shí)體和液體培養(yǎng)的菌絲體中分離出多種有效的抗腫瘤多糖[5]。目前對(duì)灰樹花多糖的提取方法多為高溫提取（80 ℃以上），以保證理想的提取率。但是提取工藝在優(yōu)化多糖提取條件的同時(shí)，應(yīng)綜合考慮多糖提取率和多糖活性兩個(gè)方面[6]。而多糖除來(lái)源外，提取溫度、提取時(shí)間和提取溶劑對(duì)提取多糖的理化性質(zhì)影響非常大[7,8]，這表明不同提取條件下提取的多糖具有不同的生物活性。高溫還可能造成大分子活性物質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆的改變，從而影響其生物活性[9]。已有研究表明較低溫提取香菇多糖在增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力、刺激T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖作用方面優(yōu)于高溫[6]。灰樹花多糖在其主鏈結(jié)構(gòu)、單糖組成、分子量、支化度、溶解性、聚合物電荷和構(gòu)象上是多樣化的，這都可能影響多糖的活性。研究表明，來(lái)自赤芝的高分子量多糖(1086 ku)和(1→3)-β-D-葡聚糖(＞788 ku)顯示出比其它較低分子量組分更好的抗腫瘤活性[10,11]。而已有研究表明，長(zhǎng)期熱處理降低了灰樹花多糖β-D-葡聚糖的分子量，高分子量的β-D-葡聚糖（800 ku）顯示出比較低分子量的β-D-葡聚糖具有更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性[7,8]。劉安軍[12]從黃芪中提取出新型冷水可溶性多糖，該多糖對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有明顯的抑制作用且能有效保護(hù)免疫器官，促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬功能，提高荷瘤小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群百分比。然而至今灰樹花多糖的提取主要采用傳統(tǒng)的熱水浸提法，也有研究發(fā)現(xiàn)以灰樹花菌絲體為原料，在不同培養(yǎng)基上浸提培養(yǎng)的五組多糖，4 ℃提取的多糖比100 ℃提取的多糖抗氧化活性更優(yōu)[13]。本文旨在研究低溫（4 ℃）條件下，灰樹花多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)表征及其抗腫瘤活性，為探索灰樹花的綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灰樹花子實(shí)體購(gòu)自天津?yàn)I海新區(qū)超市；人肝癌HepG2細(xì)胞購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)院細(xì)胞庫(kù)；人肝HL-7702細(xì)胞中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；無(wú)水乙醇、MTT、戊二醛等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；線粒體膜電位檢測(cè)（JC-1）試劑盒Solarbio。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)，日本島津；二氧化碳培養(yǎng)箱、真空冷干燥機(jī)、冷凍離心機(jī)、離子色譜儀，美國(guó)Thermo；傅立葉變換紅外光譜儀，德國(guó)布魯克儀器公司；高效液相色譜儀，日本島津；掃描電鏡：日本日立；ECLIPSE TS100倒置熒光顯微鏡，日本Nikon。

1.3 灰樹花多糖的提取和純化

灰樹花經(jīng)過(guò)冷凍干燥機(jī)干燥后，粉碎，過(guò)80目篩子，稱重后置燒杯中，加20倍（m/V）超純水浸泡，密封后置于4 ℃浸提，12 h后浸提液6500 r/min離心10 min，重復(fù)離心兩次收集上清；將上清經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融至原體積的 1/3，加無(wú)水乙醇置終濃度為 60%的乙醇中進(jìn)行沉淀多糖。再將所得醇溶液在6500 r/min，10 min條件下離心，棄上清后得到灰樹花粗多糖。然后將該粗多糖充分溶解于超純水中，加入 1/4體積Sevage溶液（氯仿:正丁醇=4:1（V:V））用于去除蛋白，重復(fù)操作4～6次。將收集到的上清液氮吹除去正丁醇。再將該多糖溶液裝入 12～14 ku的截留分子量的透析袋中透析，透析于4 ℃持續(xù)3 d，每天換三次水。之后將透析袋內(nèi)溶液冷凍干燥，產(chǎn)物命名為GFP。

1.4 單糖組成分析

本試驗(yàn)是在經(jīng)典的離子交換色譜法的基礎(chǔ)上改進(jìn)的[14]，采用離子色譜分離柱，以離子交換樹脂做固定相與流動(dòng)相中的離子進(jìn)行交換，利用待測(cè)離子對(duì)交換劑具有不同親和力這一原理實(shí)現(xiàn)分離[15]。在 10.0 mmol/L NaOH溶液為流動(dòng)相的條件下，通過(guò)脈沖安培檢測(cè)器，分離檢測(cè)八種單糖。

1.5 GFP的分子量測(cè)定及純度鑒定

采用凝膠滲透高效液相色譜法鑒定灰樹花多糖的純度，并測(cè)定其分子量[16]。

1.6 GFP的全波長(zhǎng)掃描

將GFP溶于水配成1 mg/mL的溶液，蒸餾水作參比，在200 nm～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.7 GFP的糖含量測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)以分析純葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，苯酚-硫酸法測(cè)定經(jīng)純化后的多糖樣品中糖的含量。

1.8 GFP的紅外光譜鑒定

將7 mg GFP和150 mg干燥的溴化鉀顆粒充分混合、研磨后在室溫下測(cè)定GFP的紅外光譜[16]。

1.9 微觀形態(tài)觀察

1.9.1 掃描電鏡觀察

取適量的GFP粉末鋪在導(dǎo)電膠上，用洗耳球吹去表面浮樣。在離子濺射儀中噴金處理15 s左右，即可進(jìn)行樣品掃描。觀察多糖樣品電鏡圖像，確定掃描視野，選定放大倍數(shù)為1000和2000，分別拍照記錄。

1.9.2 原子力顯微鏡觀察

將GFP凍干后，配制成0.1 μg/mL的溶液，之后取5 μL滴加到5 mm×5 mm的云母片上。經(jīng)過(guò)24 h烘箱 40 ℃晾干后，在室溫條件下，用掃描探針顯微鏡(SPI3800-SPA-400，Seiko Instruments Inc)在原子力顯微分析模式下以非接觸模式對(duì)樣品進(jìn)行掃描和拍攝，掃描速率0.5 Hz，用的是金涂層Si3N4探針，橫向分辨率為0.2 nm，垂直分辨率為0.01 nm，最大掃描范圍為100 μm×100 μm。

1.10 細(xì)胞增殖活性的測(cè)定

通過(guò)MTT[17,18]測(cè)定法測(cè)定不同濃度GFP處理的HepG2細(xì)胞與HL-7702細(xì)胞的活力，根據(jù)吸光度值計(jì)算出GFP對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。分別取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，在96孔板中接種細(xì)胞，其密度大約5×104個(gè)/mL，體積為100 μL。16 h后棄去培養(yǎng)液，分別加入不同濃度（0、50、100、200、400 μg/mL）的GFP在96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。之后在每孔中加入等量的20 μL MTT溶液(5 mg/mL)。將96孔板在培養(yǎng)箱放置4 h并離心，然后棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO并振蕩15 min以溶解形成的不溶性甲瓚。用酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)量吸光度。

其中A是GFP處理的細(xì)胞的平均光密度；B是對(duì)照孔的平均光密度。

1.11 線粒體膜電位檢測(cè)

本試驗(yàn)采用JC-1染色[19]，細(xì)胞培養(yǎng)如下：按大約2×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度將細(xì)胞接種于六孔板中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，16 h后棄培養(yǎng)基，用PBS洗3遍，加入含不同濃度的GFP（0、200、400 μg/mL）的DMEM培養(yǎng)基，以空白樣品組為對(duì)照組，每組設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。結(jié)束之后將培養(yǎng)基棄掉，用PBS緩沖液清洗三次。試驗(yàn)方法按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.12 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

將HepG2細(xì)胞(1×106個(gè)/mL)接種在6孔板內(nèi)蓋玻片（滅菌）上生長(zhǎng)，16 h后用不同濃度GFP（0、200、400 μg/mL）處理，24 h后棄去培養(yǎng)基，加入4%戊二醛固定細(xì)胞4 h，30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%無(wú)水乙醇逐級(jí)脫水，掃描電子顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.13 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20.0軟件和Sigma Plot10.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差所表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰樹花多糖的單糖組成

下圖1為2 mmol/L的標(biāo)品的離子色譜圖，圖2為相同條件下GFP的離子色譜圖。

圖1 八種單糖的離子色譜圖Fig.1 Ion chromatogram of eight monosaccharides

圖2 GFP的單糖組分Fig.2 The monosaccharide component of GFP

由離子色譜結(jié)果可知，GFP主要單糖為葡萄糖、半乳糖甘露糖。葡萄糖（40.51%～42.11%）和半乳糖（29.35%～30.35%）是主要的單糖，相對(duì)少量的是甘露糖（19.88%～20.72%），葡萄糖醛酸（1.43%～1.85%）也被發(fā)現(xiàn)在樣品中。這些結(jié)果表明，GFP主要由三種不同類型的單糖組成的雜多糖。之前也有研究發(fā)現(xiàn)不同提取溫度得到的三組灰樹花多糖樣品中葡萄糖是主要單糖(77.60%～80.90%)，還有相對(duì)少量的半乳糖(7.10%～8.20%)、甘露糖(4.30%～5.80%)、巖藻糖(4.50%～5.40%)和核糖(1.70%～1.90%)[20]，這與本試驗(yàn)研究基本一致，均為不同單糖組成的雜多糖。

2.2 GFP的分子量測(cè)定及純度鑒定

本試驗(yàn)采用分子排阻（凝膠滲透）高效液相色譜，以標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖分子量對(duì)保留時(shí)間作多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)多糖樣品色譜圖的保留時(shí)間計(jì)算多糖樣品平均相對(duì)分子量。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)低溫所提灰樹花多糖為混合物，因?yàn)樗袃蓚€(gè)主要的大分子群體。絕大部分為分子量為1700.00 ku大分子量，峰面積為66.57%。另外一部分的分子量為34.12 ku，其相應(yīng)的峰面積為28.23%。多糖分子的結(jié)構(gòu)和生物活性與多糖分子量大小直接相關(guān)。據(jù)報(bào)道，在提取過(guò)程中，高提取溫度可能導(dǎo)致高分子量群體的降解[20]。通常，小分子量多糖可能無(wú)法形成活性聚合體，表現(xiàn)出較低的生物活性[21]。

圖3 GFP高效液相色譜圖Fig.3 High performance liquid chromatography of GFP

2.3 GFP的紫外光譜掃描（UV）

圖4 GFP全波長(zhǎng)掃描Fig.4 The UV spectra of GFP

圖4為GFP的紫外光譜圖，顯示其在200 nm有最大吸收峰，在260 nm和280 nm均無(wú)明顯的光吸收，說(shuō)明GFP不含或含少量游離結(jié)合的蛋白質(zhì)、核酸類物質(zhì)。

2.4 GFP的糖含量測(cè)定

圖5 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of glucose

不同濃度分析純葡萄糖溶液為參照，用苯酚-硫酸比色法在 490 nm處測(cè)定各吸光度，以葡萄糖含量(μg/mL)為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.0019x-0.0035，R2=0.9996，測(cè)得GFP中糖含量為86.12%。

2.5 GFP的紅外光譜鑒定

采用傅立葉紅外光譜（FT-IR）分析GFP的官能團(tuán)，從圖6中可推測(cè)GFP的結(jié)構(gòu)特征、糖殘基及其構(gòu)型。

圖6 GFP紅外分析圖譜Fig.6 Infrared spectrum of GFP

圖譜中寬峰3415 cm-1波段代表了O-H拉伸振動(dòng)。2918 cm-1左右的帶是由C-H伸縮振動(dòng)導(dǎo)出的，在2919 cm-1和2000 cm-1處的弱吸收峰為C-H拉伸振動(dòng)的特征峰，這一區(qū)域的吸收峰是糖類的特征吸收峰；1420 cm-1和1250 cm-1左右的寬帶可歸屬于C-H鍵的彎曲。在1175～1000 cm-1的范圍內(nèi)，是由C-O、C-C、C-O-C和C-O-H的拉伸和彎曲振動(dòng)造成的，其強(qiáng)信號(hào)大約為1076 cm-1處[22]。

這些結(jié)果都是蘑菇多糖的典型紅外信號(hào)。1050 cm-1左右的特征帶也表明GFP中存在一個(gè)吡喃環(huán)，這說(shuō)明GFP糖環(huán)構(gòu)型為吡喃型；β型糖苷鍵的吸收峰在890 cm-1左右處，圖譜中804 cm-1的吸收峰表明糖苷鍵可能為α型，這些結(jié)果表明灰樹花多糖GFP可能為α-吡喃多糖。這進(jìn)一步證實(shí)了低溫浸提的灰樹花粗多糖水與高溫相比理化性質(zhì)相似，而其差別在于其分子量大小[20]。

2.6 微觀形態(tài)分析

GFP的掃描電鏡圖片（×1000倍和×2000倍）如圖 7（a、b）所示。GFP的原子力顯微鏡圖片如圖7（c、d）所示。

掃描電鏡能夠直觀的分析研究多糖微觀形態(tài)及空間構(gòu)象[23]，能快速有效地獲得待測(cè)物的三維立體圖像，還能細(xì)微的觀察測(cè)定被測(cè)樣品的每一個(gè)角度，不受待測(cè)樣品狀態(tài)影響[24]。

圖7 GFP微觀形態(tài)Fig.7 GFP Microscopic morphology

通過(guò)圖7a、b中可以看出，多糖呈片層狀或碎屑狀，表面質(zhì)地光滑，多糖分子間具有較強(qiáng)的相互作用力，聚集程度大。因?yàn)樵恿︼@微鏡成像的高度不可能“擴(kuò)大效應(yīng)”的影響，而將不同長(zhǎng)度和寬度卻會(huì)受到測(cè)量位置不同的影響，高度可以作為一個(gè)分子直徑的參考。通常來(lái)說(shuō)，多糖分子鏈一般為0.1～1.0 nm。圖7c、d所顯示的最大累積高度約為20 nm，這說(shuō)明每股并非為單個(gè)糖鏈，這可能是由于此多糖分子含有少量糖醛酸照成的，糖鏈上糖醛酸羧基或羧基負(fù)離子上的強(qiáng)電負(fù)性氧原子與另一糖鏈上的羥基氫易于形成分子間氫鍵這是由多糖分子末端羥基之間氫鍵。由于濃度低，沒有形成復(fù)雜的鏈狀或網(wǎng)狀與多個(gè)糖鏈纏繞成股的結(jié)構(gòu)。

2.7 GFP對(duì)HepG2細(xì)胞增殖活性的影響

多糖及其衍生物不僅作為能量的儲(chǔ)存和結(jié)構(gòu)成分，還參與信號(hào)識(shí)別和細(xì)胞間通訊，并在免疫系統(tǒng)、受精、發(fā)病機(jī)制、血液凝固和系統(tǒng)發(fā)育等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[25]。多糖還可以識(shí)別并結(jié)合一系列的細(xì)胞黏附分子進(jìn)而發(fā)揮活性[26]。

從圖8（b）可看出，GFP對(duì)人肝HL-7702細(xì)胞的增殖幾乎沒有抑制作用，當(dāng)其濃度為50 μg/mL～400μg/mL時(shí)，對(duì)HL-7702細(xì)胞的增殖抑制作用與不添加多糖樣品的沒有明顯的差異，說(shuō)明GFP對(duì)正常細(xì)胞沒有增殖抑制作用。如圖8（a）所示，不同濃度的GFP作用24 h后，可明顯抑制HepG2細(xì)胞的增殖，且隨著濃度的增加，抑制率不斷增加，并呈現(xiàn)出濃度依賴關(guān)系。當(dāng)GFP濃度為200 μg/mL時(shí)，其抑制率達(dá)到49.12%，當(dāng)GFP濃度增加為400 μg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到 76.45%。所以，低溫提取的灰樹花多糖 GFP對(duì)HepG2細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用，其抑制效果優(yōu)于灰樹花深層發(fā)酵菌絲體多糖抗腫瘤活性[27]。

圖8 GFP不同濃度對(duì)hepG2細(xì)胞（a）和HL-7702（b）細(xì)胞增殖的影響Fig.8 Effects of different concentrations of GFP on the proliferation of hepG2 cells

2.8 線粒體膜電位檢測(cè)

圖9 GFP作用于HepG2細(xì)胞的JC-1染色圖Fig.9 JC-1 staining of HepG2 cells treated with GFP

細(xì)胞凋亡早期的標(biāo)志性變化之一就是線粒體膜電位的下降。本試驗(yàn)中線粒體膜電位檢測(cè)是以JC-1為熒光探針來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位的變化，在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1以聚合物形式聚集在線粒體的基質(zhì)中，產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光。通過(guò)熒光顏色的轉(zhuǎn)變來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位的變化。由圖9可知，對(duì)照組A中JC-1表現(xiàn)為紅色熒光，與之相比，在有GFP處理的情況下，HepG2細(xì)胞綠色熒光明顯增多，并且伴隨著GFP濃度的增加細(xì)胞中的綠色熒光所占的比例越來(lái)越多，說(shuō)明線粒體膜電位降低。線粒體膜電位的降低作為線粒體膜去極化的結(jié)果，是線粒體損傷的一個(gè)指標(biāo)[28]，是凋亡的初始和不可逆步驟[29]。由此可以說(shuō)明GFP對(duì)HepG2細(xì)胞有促凋亡的作用，并且GFP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡伴隨著膜電位的改變。

2.9 GFP誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察

圖10 掃描電鏡觀察GFP誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡圖Fig.10 Observation of HepG2 cell apoptosis induced by GFP under scanning electron microscope

上圖10為GFP處理HepG2細(xì)胞24 h的掃描電鏡觀察的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。由圖10可以看出，經(jīng)過(guò)不同濃度GFP處理24 h的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化。不經(jīng)GFP處理的對(duì)照組HepG2細(xì)胞，細(xì)胞膜完整，表面微絨毛豐富且完整、規(guī)則排列、長(zhǎng)絲突起分布均勻，細(xì)胞間鑲嵌連接[30]。經(jīng)GFP作用24 h后，試驗(yàn)組細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞調(diào)亡形態(tài)，胞體體積縮小，表面微絨毛卷曲、崎變、小球結(jié)構(gòu)逐漸增多，細(xì)胞質(zhì)形成空泡，細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)消失，微核形成。這些結(jié)果與其他類型的細(xì)胞中觀察到的細(xì)胞凋亡趨勢(shì)一致[31]，可以看出GFP誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡。

3 結(jié)論

本研究利用低溫(4 ℃)提取灰樹花多糖，得到了有較好的抗腫瘤作用的功能性多糖GFP。結(jié)構(gòu)鑒定其主要單糖為葡萄糖、半乳糖和甘露糖，含有兩個(gè)主要的大分子群體，可能為α-吡喃多糖。細(xì)胞體外增殖抑制實(shí)驗(yàn)（MTT）表明GFP在一定濃度范圍內(nèi)能夠抑制肝癌細(xì)胞株HepG2的生長(zhǎng)。通過(guò)JC-1試驗(yàn)檢測(cè)到線粒體膜電位降低，說(shuō)明GFP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡伴隨著膜電位的改變。對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)GFP處理的HepG2細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡形態(tài)。這說(shuō)明低溫提取的灰樹花多糖有一定的抗腫瘤作用。Wang[32]等研究結(jié)果表明，含有甘露糖并伴隨有葡萄糖和半乳糖存在的多糖組分具有較高的抑瘤活性，單糖組成不同，其結(jié)構(gòu)和功能也有所不同。另外分子質(zhì)量也是影響多糖活性的一個(gè)重要因素，這可能與多糖分子能否形成高級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，GFP分子質(zhì)量相對(duì)較大可能有三股螺旋結(jié)構(gòu)存在，可以產(chǎn)生能形成活性的聚合結(jié)構(gòu)。而多糖分子的立體構(gòu)型發(fā)生改變，活性也會(huì)隨之消失。這在理論研究和產(chǎn)品開發(fā)上都具有非常重要的意義。