薛海燕，薛麗歡，賀寶元，王戰(zhàn)勇，許淼，白文卿

（1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安 710021）（2.陜西科技大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安710021）（3.中央儲(chǔ)備糧西安大明宮直屬庫(kù)，陜西西安 710016）

近年食源性活性肽成為食品功能因子研究的熱點(diǎn)，主要研究經(jīng)過(guò)體外可控酶解是否會(huì)產(chǎn)生活性肽及活性肽在體外的生理功能。酪蛋白是牛乳中主要的蛋白質(zhì)，而牛乳酪蛋白中包含多種人體必需的氨基酸[1]。據(jù)報(bào)道，酪蛋白經(jīng)水解可產(chǎn)生如 ACE抑制肽、抗氧化肽、抗疲勞肽等功能肽段[2]，在眾多的生物活性肽中，具有降血壓活性的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（Angiotensin I-converting enzyme inhibitor，ACEI）已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)[3]。人體胃腸道存在豐富的胃蛋白酶和胰蛋白酶，對(duì)酪蛋白具有消化作用，如張艷等[4]采用胃蛋白酶水解酪蛋白發(fā)現(xiàn)可獲得多種 ACE抑制肽片段，且具有較強(qiáng)的 ACE抑制活性，可發(fā)揮較好的抗血壓升高作用；夏鎮(zhèn)波[5]采用胃蛋白酶、胰蛋白酶分別在各自最適條件下水解酪蛋白，均可獲得 ACE抑制肽；Maruyama等[6]使用胰蛋白酶水解牛乳酪蛋白，在水解液中得到三種降血壓的二肽其肽段分別為：PP、RP及AH；在胃腸生理環(huán)境下，其水解物中是否存在 ACE抑制肽，使酪蛋白除營(yíng)養(yǎng)功能外也具有降血壓的功能有待研究；另外酪蛋白胃腸水解產(chǎn)生的ACE抑制肽要能被人體腸道以完整的形式吸收，才能發(fā)揮其相應(yīng)的生理功能，Annamaria Perna等[7]通過(guò)體外胃腸模擬水解酪蛋白對(duì)抗氧化和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）抑制能力進(jìn)行研究，表征 ACE抑制和抗氧化能力在體外胃腸消化期間活性增強(qiáng)。本文采用熒光標(biāo)記對(duì)其腸道吸收進(jìn)行了初探。

本研究通過(guò)體外模擬胃腸消化牛乳酪蛋白，檢測(cè)不同水解時(shí)間水解液的ACE抑制率，并對(duì)ACE抑制率最高的樣品進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，鑒定水解液中存在的多肽片段，和已經(jīng)報(bào)道的 ACE抑制肽進(jìn)行對(duì)比，得出牛乳酪蛋白的體外模擬消化液中是否存在 ACE抑制肽；再通過(guò)熒光標(biāo)記牛乳酪蛋白，并對(duì)其熒光標(biāo)記酪蛋白進(jìn)行模擬消化，通過(guò)電泳驗(yàn)證消化物的熒光標(biāo)記是否穩(wěn)定；最后利用腸非翻轉(zhuǎn)模型驗(yàn)證熒光標(biāo)記消化物在腸道的主要吸收部位。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳酪蛋白、胃蛋白酶、胰蛋白酶、ACE、HHL均為美國(guó)sigma公司；乙腈，美國(guó)Fisher公司；FITC；SD實(shí)驗(yàn)大鼠，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物飼養(yǎng)中心；96孔板，美國(guó)康寧公司；透析袋，上海源葉生物科技有限公司；三甲基甘氨酸（Tricine），F(xiàn)luka進(jìn)口包裝；低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，美國(guó)Amresco公司；生理鹽水，辰欣藥業(yè)股份有限公司；N,N-甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺，汕頭光華化學(xué)試劑公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；二級(jí)質(zhì)譜儀，美國(guó)Thermo fisher公司；冷凍干燥機(jī)，北京松源華興生物科技有限公司；全波長(zhǎng)功能讀數(shù)儀，賽默飛世爾科技有限公司；超濾儀，美國(guó)millipore公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 體外模擬消化牛乳酪蛋白

參照中國(guó)藥典[8]配制人工胃液及人工腸液，兩種消化液均現(xiàn)配現(xiàn)用，在使用之前置于37 ℃的水浴中預(yù)熱。

1.3.1.1 體外模擬人工胃液消化

準(zhǔn)確稱取20 g酪蛋白，將其充分溶解于1000 mL pH 9.5的PBS中，用4 mol/L的HCl調(diào)節(jié)溶液的pH至2.0，置于37 ℃水浴振蕩器中10 min。按照E/S=1:50加入40 mL人工胃液，分別在0 min、15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h取樣50 mL，2 h 取樣500 mL，在沸水中加熱10 min后調(diào)節(jié)消化液的pH至7.0，將酶滅活，所得樣品置于-20 ℃的冰箱中備用。

1.3.1.2 體外模擬人工腸液消化

配制500 mL 20 mg/mL酪蛋白溶液，置于37 ℃水浴振蕩器中10 min。按照E/S=1:50加入20 mL的人工腸液進(jìn)行消化，分別在0 min、15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h取樣50 mL，沸水中加熱10 min，儲(chǔ)存條件同上a。

1.3.1.3 體外模擬胃腸聯(lián)合消化

取經(jīng)過(guò)體外模擬胃消化2 h的樣品450 mL置于37 ℃水浴振蕩器10 min，加入人工腸液20 mL，其余操作同上b[9]。

1.3.2 酪蛋白水解度（DH）的測(cè)定

采用茚三酮法[10]測(cè)定酪蛋白模擬胃腸消化過(guò)程中水解度變化，水解度的計(jì)算公式如下：

式中，h：水解后每 g蛋白被裂解的肽鍵的毫摩爾數(shù)(mmol/g)；htot：為原料蛋白質(zhì)肽鍵(mmol/g)，牛乳酪蛋白 htot為8.3 mmol/g。

1.3.3 水解液ACE抑制活性的測(cè)定

由于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)測(cè)定 ACE抑制率的可操作性和重復(fù)性較差，本實(shí)驗(yàn)采用ACE體外活性的檢測(cè)方法[4]。將200 μL 5 mmol/L的HHL與100 mL酪蛋白水解液進(jìn)行混勻，在37 ℃預(yù)熱3 min后加入20 μL 0.1 U/mL ACE溶液，在37 ℃下反應(yīng)30 min后加入250 μL的HCl終止反應(yīng)。然后再加入1.7 mL的乙酸乙酯，手動(dòng)振蕩15 s后，靜置5 min，然后用移液槍吸取1 mL上層乙酸乙酯到指定試管中，并在120 ℃的烘箱中烘干，取出后加入3 mL的超純水，并于228 nm處測(cè)定其吸光度，ACE抑制率計(jì)算公式為如下：

式中：A為反應(yīng)中ACE抑制劑和ACE同時(shí)存在的吸光度；B為反應(yīng)中不加抑制劑的吸光度，即對(duì)照；C為ACE和HHL空白反應(yīng)的吸光度，即空白。

1.3.4 水解液的LC-MS/MS檢測(cè)

從BL側(cè)收集到的樣品，通過(guò)0.45 μm的濾膜過(guò)濾，用Spe柱對(duì)樣本進(jìn)行除鹽處理，用80%乙腈洗脫，然后真空抽干；最后再用30 μL 30%乙腈重溶，進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.3.4.1 液相參數(shù)

色譜柱信息：(300 μm i.d.×5 mm，5 μm) RSLC C18；流動(dòng)相A：0.1%甲酸，流動(dòng)相B：0.1%甲酸，80%乙腈；流速：300 nL/min；每個(gè)組分分析時(shí)間：60 min。洗脫條件如下：0 min：B相5%；5 min：5%；50 min，B相90%；55 min，B相90%；58 min，B相5%；60 min，B相5%。

1.3.4.2 質(zhì)譜參數(shù)

分離后的肽段進(jìn)入質(zhì)譜儀 Thermo Scientific Q Exactive進(jìn)行在線檢測(cè)，具體參數(shù)如下：一級(jí)質(zhì)譜參數(shù)Resolution：70000；AGC target：3e6；Maximum IT：40 ms；Scan range：50 to 750m/z（3號(hào)樣本），50 to 1800m/z(1號(hào)樣本)。二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)；Resolution：17500；AGC target：1e5；Maximum IT：60 ms；TopN：20；NCE/stepped NCE：27。

1.3.4.3 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

質(zhì)譜原始文件經(jīng)過(guò)MM File Conversion軟件處理轉(zhuǎn)換，得到MGF格式文件，然后用Mascot軟件檢索。

1.3.5 熒光標(biāo)記牛乳酪蛋白[11]

稱取牛乳酪蛋白20.0 g，溶于1000 mL pH 9.5的PBS緩沖液中，超聲30 min后于磁力攪拌器上攪拌1 h至酪蛋白完全溶解，向酪蛋白溶液中添加0.2 mg的FITC，超聲30 min后于磁力攪拌器上攪拌1 h，靜置于4 ℃冰箱中反應(yīng)24 h，調(diào)節(jié)其pH至4.6，5000 r/min離心棄去上清液，除去沒(méi)有與酪蛋白結(jié)合FITC，將樣品再次溶解，通過(guò) 1 ku的超濾膜超濾再次去除殘留FITC，此過(guò)程重復(fù)三次，使用透析袋透析24 h，每4 h換一次透析液，寬度36 mm，MW：8000～14000，將所得樣品進(jìn)行冷凍干燥后，保存于4 ℃的冰箱中。

1.3.6 SDS-PAGE分析FITC-酪蛋白水解液

FITC-酪蛋白的體外模擬消化具體過(guò)程見(jiàn) 1.3.1。取 200 μL不同消化時(shí)間水解液與同體積樣品緩沖液進(jìn)行混勻，在100 ℃加熱3 min后置于離心機(jī)上離心5 min，備用。

1.3.6.1 水解液SDS-PAGE電泳檢測(cè)[12]

分別配制12.5%和15%的分離膠，以及3%的濃縮膠，分析單胃和單腸的水解樣品。上樣量為10 μL。溴酚藍(lán)進(jìn)入上層膠時(shí)電壓設(shè)置為50 V，待溴酚藍(lán)到達(dá)下層膠時(shí)電壓設(shè)置為150 V，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)距膠底1 cm時(shí)結(jié)束電泳，使用考馬斯R-250染色1 h，最后脫色至背景干凈。

1.3.6.2 水解液Tricine-SDS-PAGE電泳檢測(cè)[13,14]

經(jīng)過(guò)胃腸聯(lián)合水解后樣品的分子量在7 ku以下，用SDS-PAGE已不能分辨水解樣品，因此采用分辨率更高 Tricine-SDS-PAGE電泳進(jìn)行分析，膠的濃度為16.5%分離膠，10%夾層膠，4%濃縮膠。溴酚藍(lán)在上層膠和夾層膠時(shí)電壓設(shè)置 60 V，到達(dá)分離膠時(shí)設(shè)置140 V，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)距膠底1 cm時(shí)結(jié)束電泳，剝膠后浸泡在固定液（50%乙醇和 10%乙酸）中固定 30min，考馬斯R-250染色1 h，脫色液脫色至背景干凈。

1.3.7 FITC-酪蛋白水解液在腸非翻轉(zhuǎn)模型中的通透性檢測(cè)

臺(tái)氏液配制見(jiàn)參考文獻(xiàn)[15]。

將購(gòu)得6只SD雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，體重250 kg±20 kg，實(shí)驗(yàn)前禁食24 h，可自由飲水，向腹腔注射10%的水合氯醛1.5 mL進(jìn)行麻醉，3 min后夾住老鼠腳趾，沒(méi)有知覺(jué)方可進(jìn)行解剖，打開(kāi)腹腔，取出小腸，剝離小腸上的粘附物，分別取十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸各5 cm，用針管吸取臺(tái)氏液緩慢沖洗四節(jié)腸段，直到?jīng)]有內(nèi)容物流出，一端扎口，向腸囊內(nèi)添加0.5 mL 20 mg/mL的FITC-酪蛋白，放入小燒杯中，加入10 mL的臺(tái)氏液，此過(guò)程快速進(jìn)行，避免腸道失去活性[16]。實(shí)驗(yàn)過(guò)程在 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行，保持37 ℃恒溫，并通入95%O2和5%CO2。分別在0 min、30 min、60 min、90 min、120 min取樣200 μL，并補(bǔ)加相同體積的臺(tái)氏液。吸取100 μL的各個(gè)樣品于96孔板中，使用全波長(zhǎng)功能讀數(shù)儀于最佳波長(zhǎng)處檢測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度。待實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，測(cè)量所用各個(gè)腸段的長(zhǎng)度，用剪刀將腸道剪開(kāi)，測(cè)定其寬度后，計(jì)算出腸道的面積。

腸囊非翻轉(zhuǎn)模型中 FITC-酪蛋白的表觀滲透系數(shù)Papp[17]用如下公式計(jì)算：

式中：dQ/dt為以FITC-酪蛋白累積吸收量對(duì)時(shí)間作積分；A為腸段的面積；C0為腸囊外FITC-酪蛋白的初始濃度。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Origin軟件作圖并用SPSS 9.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 酪蛋白水解度（DH）的變化

圖1 甘氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of glycine

圖2 消化時(shí)間對(duì)水解度影響Fig.2 Effects of digestion time on the degree of hydrolysis

從圖2中可知，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，三種消化液的水解度均明顯增加，在反應(yīng)開(kāi)始1 h內(nèi)，酶切位點(diǎn)較多，酪蛋白被很快水解，水解度迅速增加，胃消化、腸消化和胃腸聯(lián)合消化分別增加了5.19%、12.85%和19.15%。1 h后隨著酶切位點(diǎn)減少，蛋白酶的活性達(dá)到飽和，水解度增加緩慢。三種消化方式中，胃腸聯(lián)合消化產(chǎn)生水解度最高為25.51%，其原因是兩種酶消化使得酪蛋白的酶切位點(diǎn)增加，因此其水解度最高。龐廣昌等人研究表明：蛋白經(jīng)過(guò)人體消化不僅可以產(chǎn)生氨基酸為人體提供營(yíng)養(yǎng)，還會(huì)產(chǎn)生小分子的功能肽，這些功能肽進(jìn)入人體，可對(duì)發(fā)揮其相應(yīng)的生理功能[18]。因此將水解液的生理活性進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

2.2 酪蛋白水解物的ACE抑制率分析

由圖3可知，單胃和單腸消化的ACE抑制率均隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)先快速增加，隨后逐漸降低；而胃腸聯(lián)合的ACE抑制率則是先降低再增加，在2 h時(shí)，ACE抑制活性達(dá)到最高值68.03%，其ACE抑制率明顯高于兩種單獨(dú)消化方式，說(shuō)明聯(lián)合消化有利于產(chǎn)生更多具有 ACE抑制活性的肽段，并且經(jīng)過(guò)聯(lián)合消化后也可使消化物中活性肽的分子量大大降低，這有利于活性肽進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮其降血壓的功效。人工胃液消化物的 ACE抑制活性明顯高于人工腸液的消化物，這是由于人工胃液主要作用于 Phe-，Glu-，Leu-疏水氨基酸，而C末端為Phe-，Glu-，Leu-，Pro-等時(shí)具有較高的 ACE抑制活性[19]。李東平[20]等人通過(guò)酶解水牛乳蛋白制備 ACE抑制肽也得出胃蛋白酶酶解產(chǎn)物ACE抑制率較胰蛋白酶等五種酶的酶解產(chǎn)物高。

圖3 消化時(shí)間對(duì)ACE抑制率的影響Fig.3 Effects of digestion time on the ACE inhibition rate

2.3 酪蛋白水解物的LC-MS/MS結(jié)果分析

表1 2 h胃腸消化液與αs1-酪蛋白的二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detection results of 2 h gastrointestinal digestive juices with αs1-casein by LC-MS/MS

9.57 HPIKHQGLPQEVLNENL 6.96 PMIGVNQELAYFYPEL 8.12 HPIKHQGLPQEVLNEENLL 5.66 FVAPFPEVF 5.53 FYPELFR 9.33 APFPEVFGK 6.16 RYLGYLEQL 7.07 AYFYPELFR 7.56 FVAPFPEVFGK 4.73 YPELFRQFY 4.86 RYLGYEQLLR 5.34 HIQKEDVPSER 6.15 HQGLPQEVLNENLL 6.34 HPIKHQGLPQEVNENL 6.96 EPMIGVNQELAYFYPEL 5.91 HPIKHQGLPQEVLNENLLR

表2 2 h胃腸消化液與β-酪蛋白的二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection results of 2 h gastrointestinal digestive juices with β-casein by LC-MS/MS

通過(guò)對(duì)2 h胃腸模擬消化酪蛋白的消化液進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，其結(jié)果見(jiàn)表1～表4，從表中可知牛乳酪蛋白中αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白及κ-酪蛋白被胃腸消化后分別產(chǎn)生的多肽片段數(shù)目為32個(gè)、6個(gè)、24個(gè)及7個(gè)，其中最短的有6個(gè)氨基酸，最長(zhǎng)的有20個(gè)氨基酸。

從β-酪蛋白的表中分析發(fā)現(xiàn)這四個(gè)多肽片段LHLPLPL、YPVEPFTESQ、VIPPFLQPEVM、SLVYPFPGPIPN是水解后的主要存在形式。αs1-酪蛋白水解后的主要片段有 LGYLEQL、APFPEVFGK、AYFYPELFR、HQGLPQEVLNENL。

表3 2 h胃腸消化液與αs2-酪蛋白的二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果Table 3 Detection results of 2 h gastrointestinal digestive juices with αs2-casein by LC-MS/MS

表4 2 h胃腸消化液與κ-酪蛋白二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果Table 4 Detection results of 2 h gastrointestinal digestive juices with κ-casein by LC-MS/MS

αs2-酪蛋白和κ-酪蛋白水解后的主要片段如上表3和表4。通過(guò)分析上面的主要片段與已經(jīng)報(bào)道的ACE抑制肽[21]做比對(duì)發(fā)現(xiàn)，模擬消化后可能產(chǎn)生的 ACE抑制肽有 IPP、RYLGY、LHLPLP、AYFYPEL、RPKHPIKHQ及WQVLPNAVPAK。

2.4 FITC標(biāo)記酪蛋白的標(biāo)記率檢測(cè)

FITC可于酪蛋白中的氨基結(jié)合形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)酪蛋白的熒光標(biāo)記。

由圖4可進(jìn)一步知道計(jì)算出酪蛋白的熒光標(biāo)記率為 13.91%，據(jù)報(bào)道 FITC標(biāo)記抗體的最大標(biāo)記率為17.44%[22]，對(duì)比分析可知本實(shí)驗(yàn)的熒光標(biāo)記率比較高。

圖4 FITC的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of FITC

2.5 FITC-酪蛋白在人工胃液及人工腸液中的穩(wěn)定性分析

由于動(dòng)物胃腸消化體系比較復(fù)雜，酪蛋白經(jīng)動(dòng)物空腹胃腸水解后，以多肽形式在腸道內(nèi)的吸收情況難以檢測(cè)。因此采取對(duì)酪蛋白進(jìn)行FITC標(biāo)記后，追蹤酪蛋白水解物的吸收，而在動(dòng)物體內(nèi)是否能穩(wěn)定標(biāo)記就需通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初步驗(yàn)證。體外模擬胃腸消化FITC-酪蛋白，對(duì)其水解液用SDS-PAGE電泳進(jìn)行分析。電泳分析的條件如下：人工胃液和人工腸液消化1 h以內(nèi)樣品采用12.5%的分離膠進(jìn)行分離，2～5 h時(shí)采用15%的分離膠進(jìn)行分離，胃腸聯(lián)合消化后由于分子量太小，用一般的電泳條件已經(jīng)不能檢測(cè)出條帶，因此使用Tricine電泳進(jìn)行分離。

2.5.1 胃液消化物的電泳分析

圖5 人工胃液消化1 h樣品SDS-PAGE電泳圖Fig.5 SDS-PAGE electrophoretograms of artificial gastric juice sample digested within 1 h

由圖5可知，a圖中FITC-酪蛋白的分子量分布于25～32 ku之間，經(jīng)胃液水解15 min后，大部分的FITC-酪蛋白被迅速分解，蛋白條帶的分子量主要集中在25 ku以下，熒光條帶在相同位置出現(xiàn)。隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，分子量在22～25 ku的條帶逐漸模糊，而分子量在17 ku條帶顏色逐漸加深，且熒光條帶隨著蛋白條帶的遷移而變化。由此說(shuō)明隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)ITC-酪蛋白被消化成小分子的蛋白質(zhì)或多肽，但熒光的標(biāo)記卻依然存在。

圖6 人工胃液消化1～5 h樣品SDS-PAGE電泳圖Fig.6 SDS-PAGE electrophoretograms of artificial gastric juice sample digested from 1 h to 5 h

由圖6可知，在胃水解2 h時(shí)蛋白條帶主要集中在17 ku左右，隨著水解的時(shí)間的延長(zhǎng)，5 h時(shí)分子量為17 ku的蛋白條帶逐漸變淺，11 ku的蛋白條帶逐漸加深，在此過(guò)程中，對(duì)應(yīng)的熒光條帶也一直清晰，由此說(shuō)明經(jīng)過(guò)人工胃液消化，F(xiàn)ITC-酪蛋白被水解為分子量稍小的蛋白質(zhì)或多肽且熒光標(biāo)記依然存在。

2.5.2 腸液消化物的電泳分析

由圖7可知，經(jīng)人工腸液水解15 min后，大部分的 FITC-酪蛋白被水解，蛋白條帶主要分布于 17 ku左右，且熒光條帶依然清晰。

由圖8可知，水解2 h后，蛋白條帶主要的分布于11 ku以下，熒光條帶在相同的位置出現(xiàn)，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，5 h后蛋白條帶和熒光條帶逐漸變得模糊。由人工胃液和人工腸液電泳結(jié)果對(duì)比可知，在相同的消化時(shí)間內(nèi) FITC-酪蛋白更容易被人工腸液所消化。

圖7 人工腸液消化1 h樣品SDS-PAGE電泳圖Fig.7 SDS-PAGE electrophoretogram of artificial intestinal juice sample digested within 1 h

圖8 人工腸液消化2～5 h樣品SDS-PAGE電泳圖Fig.8 SDS-PAGE electrophoretograms of artificial intestinal juice sample digested from 2 h to 5 h

2.5.3 胃腸聯(lián)合消化物的電泳分析

圖9 人工胃腸聯(lián)合消化15 min～5 h樣品Tricine-SDS-PAGE電泳圖Fig.9 Tricine-SDS-PAGE electrophoretograms of artificial gastrointestinal juice sample digested from 15 min to 5 h

由圖9可知，經(jīng)過(guò)胃腸液消化15 min后，F(xiàn)ITC-酪蛋白的分子量主要分布于5 ku左右，經(jīng)水解2 h后，蛋白條帶主要集中于5 ku以下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白條帶和熒光條帶都逐漸變得模糊，且更小分子量的條帶沒(méi)有觀察到，可能原因是由于水解產(chǎn)生了分子量太小，難于固定在凝膠中；也可能是因?yàn)榉肿恿孔冃。谌旧倪^(guò)程中不易于染料結(jié)合，再經(jīng)過(guò)脫色很容易發(fā)生逸散，所以不容易看到條帶出現(xiàn)。綜合以上電泳結(jié)果可知，F(xiàn)ITC-酪蛋白經(jīng)胃腸水解2 h仍保持有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，可用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)小分子多肽的腸吸收追蹤。

2.6 不同腸段對(duì)FITC-酪蛋白水解液的通透性分析

圖 10是不同腸段腸囊外液中的熒光強(qiáng)度，在Em=520 nm處均有最大的熒光強(qiáng)度，因此選擇520 nm處的熒光強(qiáng)度進(jìn)行下面實(shí)驗(yàn)的分析。由于不同腸段外液中均檢測(cè)出熒光，可以初步判斷，不同腸段均可吸收胃腸消化2 h FITC-酪蛋白水解液，但在不同腸段外液的熒光強(qiáng)度均存在一定的差異。結(jié)合圖 3～13可知在 2 h時(shí)，十二指腸的腸囊外液熒光強(qiáng)度最強(qiáng)為216.12，顯著高于回腸和結(jié)腸兩個(gè)腸段（p＜0.05），由此說(shuō)明在2 h時(shí)十二指腸對(duì)FITC-酪蛋白水解液具有最大吸收作用。而整個(gè)吸收過(guò)程看熒光強(qiáng)度的變化可知，十二指腸吸收＞空腸吸收＞回腸吸收＞結(jié)腸吸收，而該結(jié)果與一般藥物或食物在小腸的吸收情況基本一致[23]。出現(xiàn)該結(jié)果的原因可能是因?yàn)镻-糖蛋白在十二指腸、空腸、回腸及結(jié)腸中的含量依次增加，從而降低了食物在腸道的轉(zhuǎn)運(yùn)量[24]。張倩利用腸翻轉(zhuǎn)模型檢測(cè) FITC-鹿茸蛋白是否可以透過(guò)腸道，檢測(cè)結(jié)果為小于45 ku的分子可透過(guò)腸粘膜吸收，而酪蛋白水解液的分子量均在5 ku以下，因此也完全有可能通過(guò)腸道粘膜被吸收[25]。

圖10 胃腸水解液在不同腸段外液的熒光強(qiáng)度Fig.10 Fluorescence intensity of gastrointestinal digestive juices in the different intestines truncation outside liquid

圖11 2 h胃腸消化液在不同腸段外液的表觀滲透系數(shù)Fig.11 Apparent permeability coefficient of 2 h gastrointestinal digestive juices in the different intestines truncation outside liquid

由圖11可知，120 min時(shí)十二指腸Papp顯著高于其它三個(gè)腸段（p＜0.05），表明FITC-酪蛋白水解液主要在十二指腸被吸收，下來(lái)依次為空腸、回腸和結(jié)腸，再次驗(yàn)證了 FITC-酪蛋白水解液在整個(gè)腸道都能被吸收，且在小腸可能存在特定吸收的部位。FITC-酪蛋白水解液在各個(gè)腸段的表觀滲透系數(shù)均小于Papp＜1.8×10-4cm/min，而低于該值表示化合物在體內(nèi)較難吸收[26]，由此推斷，與一般化學(xué)藥物相比，F(xiàn)ITC-酪蛋白水解液不易被人體吸收，其原因可能是因?yàn)槔业鞍姿庖褐卸嚯牡姆肿恿刻?，受到腸道的屏障作用。

3 結(jié)論

綜上所述，研究結(jié)果表明，通過(guò)體外模擬胃腸消化牛乳酪蛋白，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，人工胃液消化、人工腸液消化、胃腸聯(lián)合消化三種消化方式的水解度均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，單胃和單腸消化的 ACE抑制率均隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)先快速增加，隨后逐漸降低，而胃腸聯(lián)合的 ACE抑制率則是先降低再增加，胃腸聯(lián)合消化產(chǎn)生水解度和 ACE抑制率均為最高，使用二級(jí)質(zhì)譜對(duì)多肽進(jìn)行片段鑒定，得出確實(shí)存在ACE抑制肽，其多肽片段為IPP、RYLGY、LHLPLP、AYFYPEL、RPKHPIKHQ及WQVLPNAVPAK；體外模擬消化熒光標(biāo)記酪蛋白，SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE都表明FITC-酪蛋白經(jīng)過(guò)胃腸消化后熒光標(biāo)記穩(wěn)定存在，且水解物的分子量在5 ku以下，并可被大鼠腸道吸收，由腸非翻轉(zhuǎn)模型結(jié)果得出酪蛋白消化液主要在十二指腸被吸收，下來(lái)，依次為空腸、回腸和結(jié)腸。牛乳酪蛋白消化后具有ACE抑制活性，可能發(fā)揮一定的生理作用。