楊新宇　李波　趙琰楓　王嫩寒　張潔　易俊莉　田麗麗　任怡宣 樊瑞芳　趙文娟　陳昊　陳雙雙　代小偉　丁北川

實(shí)驗(yàn)室診斷是結(jié)核病診斷、治療及預(yù)防控制過(guò)程中所必需的。結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢查尤其是細(xì)菌學(xué)檢查是發(fā)現(xiàn)傳染源的最主要手段，是確診結(jié)核病和選擇治療方案的主要依據(jù)，也是考核療效、評(píng)價(jià)防治效果的可靠標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性首先取決于標(biāo)本的質(zhì)量[1]。正確地采集、留取標(biāo)本是直接影響檢驗(yàn)結(jié)果的重要因素和取得準(zhǔn)確結(jié)果的前提[2]。世界衛(wèi)生組織在《2017年全球結(jié)核病報(bào)告》[3]中指出，2016年在世界范圍內(nèi)約有1040萬(wàn)例結(jié)核病新發(fā)患者，發(fā)現(xiàn)并得到正式報(bào)告的僅為630萬(wàn)例，留下的缺口有410萬(wàn)例。結(jié)核病患者漏診和漏報(bào)問(wèn)題仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，痰液檢查是診斷肺結(jié)核的重要手段，如未能及時(shí)留取合格的痰標(biāo)本，將會(huì)延誤患者的診斷和治療[4]。筆者收集了2016年至2017年在北京結(jié)核病控制研究所初診并最終被確診為肺結(jié)核的564例患者的1692份痰標(biāo)本，分析痰標(biāo)本質(zhì)量對(duì)分枝桿菌涂片、培養(yǎng)結(jié)果的影響，為臨床診斷、治療工作提供參考。

資料和方法

一、研究對(duì)象及診斷標(biāo)準(zhǔn)

1．研究對(duì)象：收集2016年1月至2017年12月初次就診于北京結(jié)核病控制研究所門診部，并最終被診斷為肺結(jié)核的564例患者。每例患者初診時(shí)留取3份痰標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查，包括3份抗酸染色涂片檢查，并選擇其中2份性狀較好的痰標(biāo)本同時(shí)做分枝桿菌培養(yǎng)；培養(yǎng)項(xiàng)目根據(jù)患者的病情、需求及經(jīng)濟(jì)能力進(jìn)行選擇[固體培養(yǎng)或液體培養(yǎng)(BACTEC MGIT 960)]。

2．資料來(lái)源：以實(shí)驗(yàn)室檢查為主，結(jié)合胸部影像學(xué)檢查和患者的臨床表現(xiàn)，以及必要的輔助檢查和鑒別診斷，綜合分析后確診為肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本。

3．診斷標(biāo)準(zhǔn)：按照《WS 288—2008 肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》,肺結(jié)核分確診患者、臨床診斷患者和疑似患者。本研究?jī)H討論確診患者和臨床診斷患者。

確診患者診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)痰涂片陽(yáng)性肺結(jié)核。①2份痰標(biāo)本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽(yáng)性；②1份痰標(biāo)本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽(yáng)性+胸部影像學(xué)檢查有與活動(dòng)性肺結(jié)核相符的病變；③1份痰標(biāo)本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽(yáng)性+1份痰分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性。(2)僅分枝桿菌分離培養(yǎng)陽(yáng)性+胸部影像學(xué)檢查有與活動(dòng)性肺結(jié)核相符的病變。(3)肺組織病理學(xué)檢查符合結(jié)核病病理改變。

臨床診斷患者：3次痰涂片均為陰性，胸部影像學(xué)檢查有與活動(dòng)性肺結(jié)核相符的病變，并伴以下任一條：(1)臨床有肺結(jié)核可疑癥狀；(2)結(jié)核菌素試驗(yàn)強(qiáng)陽(yáng)性；(3)結(jié)核抗體檢查陽(yáng)性；(4)肺外組織活檢病理診斷為結(jié)核病變；(5)疑似肺結(jié)核患者經(jīng)診斷性治療或隨訪觀察可排除其他肺部疾病者[5]。

二、試劑及方法

1．試劑：萋-尼抗酸染色液，酸性羅氏培養(yǎng)基由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供，BACTEC MGIT 960 分枝桿菌培養(yǎng)管由美國(guó)BD公司提供。

2．痰涂片檢測(cè)方法及分級(jí)報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)：痰涂片鏡檢采用萋-尼染色，按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[6](簡(jiǎn)稱《規(guī)程》)進(jìn)行抗酸桿菌痰涂片鏡檢。鏡檢結(jié)果分級(jí)報(bào)告結(jié)果：(1)萋-尼染色抗酸桿菌陰性，即連續(xù)觀察 300個(gè)不同視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌；(2)萋-尼染色抗酸桿菌陽(yáng)性，即抗酸桿菌菌數(shù)為1～8條/300個(gè)視野；(3)萋-尼染色抗酸桿菌陽(yáng)性“+”，即3～9條/100個(gè)視野，連續(xù)觀察300個(gè)視野；(4)萋-尼染色抗酸桿菌陽(yáng)性“++”，即1～9條/10個(gè)視野，連續(xù)觀察100個(gè)視野；(5)萋-尼染色抗酸桿菌陽(yáng)性“+++”，即1～9條/視野；(6)萋-尼染色抗酸桿菌陽(yáng)性“++++”，即≥10條/視野[6]。統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算時(shí)根據(jù)菌量，分為“1～8條/300個(gè)視野、+和++、+++和++++”3個(gè)數(shù)量等級(jí)進(jìn)行比較。

3．痰培養(yǎng)檢測(cè)方法及分級(jí)結(jié)果判讀：分枝桿菌固體培養(yǎng)采用簡(jiǎn)單法，液體培養(yǎng)采用中和離心法。按照《規(guī)程》進(jìn)行分枝桿菌分離培養(yǎng)檢查。分級(jí)結(jié)果判讀：(1)無(wú)菌落生長(zhǎng)報(bào)告為培養(yǎng)陰性；(2)菌落生長(zhǎng)不及斜面1/4時(shí)，則報(bào)告實(shí)際菌落數(shù)；(3)菌落占斜面面積1/4時(shí)報(bào)告“+”；(4)菌落占斜面面積1/2時(shí)報(bào)告“++”；(5)菌落占斜面面積3/4時(shí)報(bào)告“+++”；(6)菌落布滿培養(yǎng)基斜面報(bào)告“++++”。固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)的陽(yáng)性培養(yǎng)物均需經(jīng)涂片顯微鏡檢查確定為抗酸桿菌后方可報(bào)告[6]。統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算時(shí)根據(jù)菌量，將報(bào)告分為“實(shí)際菌落數(shù)、+和++、+++和++++”3個(gè)數(shù)量等級(jí)進(jìn)行比較。

4．痰性狀分類標(biāo)準(zhǔn)：(1)干酪痰。標(biāo)本外觀以黃色或奶酪色、膿樣、團(tuán)塊狀的肺泡分泌物為主，稠度較黏液痰低，制片時(shí)較易涂抹。(2)血痰。此類標(biāo)本是在黏液痰或干酪痰標(biāo)本中混有血液，顏色為褐色或深褐色、鮮紅色或伴有血絲。(3)黏液痰。標(biāo)本外觀以白色、黏稠度較高的肺部和支氣管分泌物為主。干酪痰、血痰及黏液痰為合格標(biāo)本。(4)唾液。目視觀察標(biāo)本整體外觀，以透明或半透明水樣、黏稠度較低的口腔分泌物為主，標(biāo)本中有時(shí)伴有氣泡；由于唾液標(biāo)本進(jìn)行抗酸桿菌檢查時(shí)的檢出率很低，在患者確定診斷時(shí)為不合格標(biāo)本[6]。

5．質(zhì)量控制：按照《規(guī)程》要求，進(jìn)行抗酸桿菌痰涂片鏡檢及分枝桿菌培養(yǎng)的室內(nèi)質(zhì)量控制及室間質(zhì)量評(píng)價(jià)[6]。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

一、初診肺結(jié)核患者3份痰標(biāo)本性狀分析

564例初診肺結(jié)核患者中，確診患者242例，占42.9%(242/564)。3份痰標(biāo)本均合格者311例，占55.1%(311/564)；3份標(biāo)本均合格的患者中，確診患者占51.4%(160/311)。3份標(biāo)本均不合格者118例，占20.9%(118/564)；其中確診患者占22.9%(27/118)(表1)。3份痰標(biāo)本均合格者細(xì)菌學(xué)檢查確診為肺結(jié)核患者的比率是3份均不合格痰標(biāo)本者的2.2倍(51.4/22.9)。

二、不同檢測(cè)方法在合格痰標(biāo)本和不合格痰標(biāo)本中的陽(yáng)性分布情況

564例初診肺結(jié)核患者共收集1692份痰標(biāo)本，其中痰涂片檢查1692份，固體培養(yǎng)檢查992份，液體培養(yǎng)檢查136份。 1692份痰標(biāo)本中，合格者1138份，合格率67.3%；初診肺結(jié)核中合格痰標(biāo)本涂片、固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)陽(yáng)性率分別為21.1%、37.4%和68.0%(表2)。不合格痰標(biāo)本涂片、固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)陽(yáng)性率分別為3.4%、16.2%和27.8%；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，涂片、固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)的陽(yáng)性率在合格痰標(biāo)本和不合格痰標(biāo)本中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為89.637、44.037、17.509，P值均<0.001)。不論是合格標(biāo)本還是不合格標(biāo)本，液體培養(yǎng)的陽(yáng)性率均明顯高于固體培養(yǎng)(表3)；在564例初診肺結(jié)核患者中，有124例患者同時(shí)進(jìn)行了固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)，固體培養(yǎng)的陽(yáng)性率為40.3%(50/124),液體培養(yǎng)的陽(yáng)性率為56.5%(70/124)。

三、初診肺結(jié)核患者不同性狀陽(yáng)性痰標(biāo)本在涂片、固體培養(yǎng)檢查中量化分級(jí)結(jié)果比較

1692份痰標(biāo)本中共檢出陽(yáng)性涂片259份，合格痰標(biāo)本陽(yáng)性涂片主要分布在“+和++”，不合格痰標(biāo)本陽(yáng)性涂片主要集中在“1～8條”及“+和++”。不同痰性狀的標(biāo)本，涂片陽(yáng)性結(jié)果在不同量化分級(jí)標(biāo)本間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.99，P=0.016)(表4)。 992份痰標(biāo)本中用固體培養(yǎng)法共檢出陽(yáng)性標(biāo)本307份，合格痰標(biāo)本固體培養(yǎng)陽(yáng)性者在不同分級(jí)標(biāo)本中呈較平均分布，不合格痰標(biāo)本的陽(yáng)性者主要集中在“+”以下；不同痰性狀的標(biāo)本，培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果在不同量化分級(jí)標(biāo)本間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.05，P<0.001)(表5)。

表1　不同診斷分類肺結(jié)核初診患者在各類3份痰標(biāo)本組合中的分布(例)

表2　1138份不同性狀合格痰標(biāo)本采用3種技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果分析

注部分標(biāo)本總份數(shù)不到30份，計(jì)算陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故陽(yáng)性率不做統(tǒng)計(jì)

表3　不同檢測(cè)技術(shù)對(duì)合格與不合格痰標(biāo)本的檢測(cè)陽(yáng)性率比較

表4　不同涂片量化分級(jí)標(biāo)本在合格與不合格痰標(biāo)本中涂片陽(yáng)性結(jié)果的比較

表5　不同培養(yǎng)量化分級(jí)標(biāo)本在合格與不合格痰標(biāo)本中固體培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果的比較

討　　論

《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》[7]標(biāo)準(zhǔn)已于2018年5月1日實(shí)施，病原學(xué)診斷是肺結(jié)核診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。檢驗(yàn)結(jié)果正確與否關(guān)鍵在于質(zhì)量保證體系，質(zhì)量保證體系分為分析前、分析中和分析后的質(zhì)量控制。導(dǎo)致臨床實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)差錯(cuò)，多數(shù)在分析前或分析后階段[8]。在實(shí)驗(yàn)誤差中，分析前誤差約占70%，因此分析前質(zhì)量保證是臨床實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證體系中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一，是確保檢驗(yàn)信息正確有效的先決條件[9-10]。而微生物實(shí)驗(yàn)室分析前質(zhì)量失控的主要原因是臨床送檢標(biāo)本不合格[11]。

《“十三五”全國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃》明確提出，到2020年肺結(jié)核患者病原學(xué)陽(yáng)性率要達(dá)到50%以上[12]，2016—2017年我研究所細(xì)菌學(xué)檢查陽(yáng)性率為42.9%，距離“十三五”要求還有一定差距。任何病原學(xué)檢查項(xiàng)目，合格痰標(biāo)本的留取對(duì)于檢查結(jié)果的影響都至關(guān)重要。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是涂片結(jié)果還是培養(yǎng)結(jié)果，合格痰標(biāo)本(干酪痰、血痰、黏液痰)的陽(yáng)性檢出率及量化分級(jí)指標(biāo)均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于不合格標(biāo)本(唾液)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在259份抗酸桿菌涂片陽(yáng)性的痰標(biāo)本中不合格標(biāo)本(唾液)占19份，陽(yáng)性檢出率極低，僅為3.4%；不合格標(biāo)本在分枝桿菌培養(yǎng)檢查中不但陽(yáng)性率低，而且在陽(yáng)性量化分級(jí)中主要集中在菌量較小的“+”以下；3份痰標(biāo)本均合格者細(xì)菌學(xué)檢查確診為肺結(jié)核患者的比率是3份均不合格痰標(biāo)本者的2.2倍；痰涂片陽(yáng)性率和痰培養(yǎng)陽(yáng)性率隨痰質(zhì)量的提高而增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；說(shuō)明了痰標(biāo)本質(zhì)量在肺結(jié)核診斷中的重要性[13]。采用液體培養(yǎng)法進(jìn)行處理的痰標(biāo)本，無(wú)論是合格痰標(biāo)本還是不合格痰標(biāo)本，陽(yáng)性率均明顯高于固體培養(yǎng)，即使唾液標(biāo)本檢測(cè)陽(yáng)性率還是比較低(27.8%)，但是也已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其在固體培養(yǎng)中的陽(yáng)性率(16.2%)；對(duì)于相同研究對(duì)象(同時(shí)進(jìn)行固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)的124例患者)液體培養(yǎng)的陽(yáng)性率提高了16.2%。張娟等[14]也報(bào)道，全自動(dòng)MGIT 960液體培養(yǎng)方法的敏感度和特異度均高于羅氏固體培養(yǎng)法，分析認(rèn)為固體培養(yǎng)對(duì)于痰標(biāo)本的前處理采用的是4%氫氧化鈉，而液體培養(yǎng)前處理采用的是2%氫氧化鈉，在控制好污染率的同時(shí)縮短了分枝桿菌的陽(yáng)性報(bào)告時(shí)間[15]；由于液體培養(yǎng)的前處理液采用的是較低濃度氫氧化鈉處理痰標(biāo)本，以及離心集菌的前處理方法，因而增加了對(duì)菌量較少標(biāo)本的陽(yáng)性檢出率。故筆者推薦實(shí)驗(yàn)室分枝桿菌分離培養(yǎng)盡可能采用液體培養(yǎng)的方法，以提高陽(yáng)性率。另外，對(duì)于痰液性狀的判斷，每個(gè)檢驗(yàn)者主觀認(rèn)識(shí)有差異，單純用干酪痰、血痰、黏液痰、唾液區(qū)分不能客觀地反映痰標(biāo)本是否合格，合格的痰標(biāo)本為平均每低倍鏡視野里鱗狀上皮細(xì)胞應(yīng)小于10個(gè)，白細(xì)胞數(shù)應(yīng)大于25個(gè)，痰標(biāo)本白細(xì)胞數(shù)是診斷肺結(jié)核痰標(biāo)本可接受的一個(gè)指標(biāo)[16]。因此，筆者認(rèn)為用量化細(xì)胞數(shù)更能反映痰標(biāo)本是否合格，建議將標(biāo)本性狀和細(xì)胞數(shù)一同報(bào)告在結(jié)果中，為臨床提供可靠的參考依據(jù)。

北京市按照《北京市結(jié)核病防治規(guī)劃(2011—2015年)》[17]的要求切實(shí)加強(qiáng)肺結(jié)核患者的發(fā)現(xiàn)力度，強(qiáng)調(diào)了綜合醫(yī)療機(jī)構(gòu)與結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)(簡(jiǎn)稱“結(jié)防機(jī)構(gòu)”)合作的重要性，開展結(jié)核病“醫(yī)防合作”的防治模式[18]，通過(guò)加強(qiáng)對(duì)密切接觸者篩查、新生入學(xué)體檢等措施，重視和加強(qiáng)主動(dòng)發(fā)現(xiàn)策略，穩(wěn)步推進(jìn)結(jié)核病“早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療”[19]。因此推測(cè)，由于許多肺結(jié)核患者是在發(fā)病早期或者沒有臨床癥狀的階段被發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致患者的痰標(biāo)本性狀不容易達(dá)到合格的要求。本研究顯示，在564例肺結(jié)核患者1692份痰標(biāo)本中，3份標(biāo)本均合格者占55.1%(311/564)，2份標(biāo)本合格者占12.4%(70/564), 1份標(biāo)本合格者占11.5%(65/564),3份標(biāo)本均不合格者占20.9%(118/564)。在肺結(jié)核患者的3份痰標(biāo)本中，有23.9%的患者留出過(guò)合格的痰標(biāo)本，說(shuō)明即使留取困難，這部分患者仍然有可能留出合格的痰標(biāo)本。

《國(guó)際醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可準(zhǔn)則》明確要求要監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)全程(TTP)的質(zhì)量。目前，分析階段的誤差得到了有效控制；而分析前、后階段的誤差成為影響質(zhì)量的主要因素。因而,監(jiān)測(cè)與改善分析階段外的質(zhì)量將是我們面臨的任務(wù)[20]。通過(guò)加強(qiáng)醫(yī)生-護(hù)士-患者的合作，用有效數(shù)據(jù)直接與患者進(jìn)行溝通，強(qiáng)調(diào)痰標(biāo)本質(zhì)量對(duì)于檢出率的重要性，強(qiáng)調(diào)合格痰標(biāo)本是來(lái)自支氣管或肺深部的膿樣、干酪樣或黏液樣痰液，痰量不少于3 ml；用發(fā)放宣傳卡片、觀看視頻等方式進(jìn)行有效的宣傳教育(簡(jiǎn)稱“宣教”)。宣傳資料的詞句盡可能減少使用過(guò)于專業(yè)的詞匯，做到簡(jiǎn)單易懂；對(duì)痰少不能咳出者，指導(dǎo)其有效咳嗽排痰的技巧，可采用背部叩擊法誘導(dǎo)排痰[21]；對(duì)無(wú)咳嗽、無(wú)痰患者，醫(yī)生可開醫(yī)囑給予2.5%氯化鈉霧化吸入導(dǎo)痰[22]；必要時(shí)與患者家屬溝通，幫助和指導(dǎo)患者采用正確的方式采集標(biāo)本,切實(shí)提高患者留取合格痰標(biāo)本的比例。

綜上所述，本研究初診肺結(jié)核患者痰標(biāo)本的留取合格率較低，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)患者的宣教力度，充分說(shuō)明痰標(biāo)本質(zhì)量對(duì)檢查結(jié)果的重要性，并采取切實(shí)有效的指導(dǎo)和措施，保證分析前留取痰液的質(zhì)量控制；鑒于液體培養(yǎng)的敏感度及特異度均較高，有能力的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)積極開展液體培養(yǎng)，以提高分枝桿菌檢出陽(yáng)性率，從而保證肺結(jié)核診斷的準(zhǔn)確性。