黃曉梅，趙紅曉，范金霞，陳秀玲

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱　150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院，哈爾濱　150030；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，哈爾濱　150030）

天然纖維素酶活性、產(chǎn)率低且成本高[1]。篩選高產(chǎn)纖維素酶生產(chǎn)菌株具有重要意義[2]。選育產(chǎn)纖維素酶菌株可彌補(bǔ)野生菌株不足，但存在酶活力不高，菌種退化現(xiàn)象[3]，未形成規(guī)?；a(chǎn)，需不斷誘變選育高效產(chǎn)酶菌株并改善其發(fā)酵工藝使其達(dá)最佳產(chǎn)酶效果。

研究采用單因子及復(fù)合因子誘變方法，改造菌株同時(shí)優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基及發(fā)酵條件，并采用培養(yǎng)條件易于控制、生產(chǎn)效率高且不易染菌的液態(tài)發(fā)酵方法培養(yǎng)菌株。綠色木霉具有實(shí)用價(jià)值，除具有較強(qiáng)分解天然纖維素能力，還有抑菌、促生、抗重金屬和產(chǎn)抗生素等作用。因此，本研究分別利用UV、DES和NaNO2誘變及UV和DES、UV和NaNO2復(fù)合誘變方法處理綠色木霉菌株，選育纖維素酶高產(chǎn)突變株。優(yōu)化高產(chǎn)纖維素酶突變株發(fā)酵工藝，確定最適發(fā)酵條件，為高產(chǎn)纖維素酶菌株開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1菌種

綠色木霉（T.viride）AS3.3711菌株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物菌種保藏中心。

1.1.2培養(yǎng)基

斜面和平板培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）[4]。

篩選培養(yǎng)基：CMC-Na 7.5～10 g·L-1，（NH4）2SO41.4 g·L-1，脲 0.3 g·L-1，KH2PO42.0 g·L-1，CaCl20.3 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.3 g·L-1，蛋白胨 0.5～1.0 g·L-1，吐溫 80 1.0～2.0 g·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 1.4 mg·L-1，MnSO4·H2O 1.6 mg·L-1，CoCl22.0 mg·L-1，pH 5～6[5]，剛果紅 0.2 g·L-1，瓊脂 20 g·L-1。

種子液培養(yǎng)基：馬鈴薯液體培養(yǎng)基（PD）。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：蛋白胨3 g·L-1，硫氨2 g·L-1，酵母膏 0.5 g·L-1，KH2PO44 g·L-1，CaCl2·2H2O 0.3 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.3 g·L-1，吐溫 80 0.2 g·L-1，碳源23.5 g·L-1[6]，根據(jù)試驗(yàn)需要，調(diào)整培養(yǎng)基成分。

1.2　誘變和篩選

1.2.1孢子懸液制備

取活化培養(yǎng)4 d綠色木霉平板，無(wú)菌水沖洗下孢子，經(jīng)3層無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾至盛有玻璃珠無(wú)菌三角瓶中，振蕩15 min，使孢子分散，稀釋成濃度為1×106個(gè)·mL-1孢子懸液。

1.2.2單因子及復(fù)合因子誘變

紫外線（UV）誘變：在暗室無(wú)菌工作臺(tái)上用30 W紫外燈，在距離30 cm涂布孢子的篩選培養(yǎng)基平板上分別照射60、180、300、420、540和660 s，以未處理組作對(duì)照，3次重復(fù)，置于28℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)5 d，計(jì)算致死率，選取每個(gè)處理中水解圈最大菌株液體發(fā)酵測(cè)定酶活。

硫酸二乙酯（DES）誘變：在制備好的孢子懸液中分別加入2%DES混勻，于28℃條件下黑暗振蕩處理10、20、30、40、50和60 min后加入Na2S2O3溶液終止反應(yīng)。稀釋后取50 μL孢子懸液均勻涂布于篩選培養(yǎng)基平板上，以未處理組作對(duì)照，3次重復(fù)，置于28℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)5 d，計(jì)算致死率，選取每個(gè)處理中水解圈最大菌株液體發(fā)酵測(cè)定酶活。

亞硝酸鈉（NaNO2）誘變：用無(wú)菌水將孢子懸液梯度稀釋至1×10-5個(gè)·mL-1，取2.0 mL懸液和0.1 mol·L-1NaNO21.0 mL混勻，28℃下分別保溫5、10、15、20、25和30 min，然后加入0.2 mol·L-1pH為4.4醋酸緩沖液1.0 mL，28℃保溫10 min，加入2.0 mL pH為8.6 Na2HPO4中和以終止反應(yīng)，各取0.1 mL均勻涂布于篩選培養(yǎng)基平板，3次重復(fù)，以未處理組作對(duì)照，置于28℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)5 d，計(jì)算致死率，選取每個(gè)處理中水解圈最大菌株液體發(fā)酵測(cè)定酶活。

UV和DES復(fù)合誘變處理：根據(jù)UV和DES對(duì)菌株處理結(jié)果，確定復(fù)合誘變中UV照射時(shí)間和DES誘變時(shí)間，將誘變后孢子懸液適當(dāng)稀釋均勻涂布于篩選培養(yǎng)基平板上，以未處理組作對(duì)照，3次重復(fù)，置于28℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)5 d，計(jì)算致死率，每個(gè)處理選取多個(gè)水解圈較大菌株液體發(fā)酵測(cè)定酶活。

UV和NaNO2復(fù)合誘變處理：根據(jù)UV和NaNO2對(duì)菌株處理結(jié)果，確定復(fù)合誘變中UV照射時(shí)間和NaNO2誘變時(shí)間，將誘變后孢子懸液適當(dāng)稀釋均勻涂布于篩選培養(yǎng)基平板上，以未處理組作對(duì)照，3次重復(fù)，置于28℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)5 d，計(jì)算致死率，每個(gè)處理選取多個(gè)水解圈較大菌株液體發(fā)酵測(cè)定酶活。

致死率（%）=（處理菌株數(shù)-對(duì)照菌株數(shù)）/對(duì)照菌株數(shù)×100%。

1.2.3復(fù)篩

初篩獲得菌株傳代10代，接入發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中復(fù)篩。以PD培養(yǎng)基1%接種孢子懸液，30℃，150 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)48 h，制備種子液。按產(chǎn)酶培養(yǎng)基10%接種種子液振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定發(fā)酵液纖維素酶活，每個(gè)處理均重復(fù)3次。

1.3　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[7]，略有改進(jìn)。

1.4　纖維素酶活力測(cè)定

纖維素粗酶液制備：發(fā)酵液經(jīng)5 000 r·min-1離心10 min，上清液即為粗酶液。

纖維素酶活測(cè)定：測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[8]，略有改進(jìn)。測(cè)定時(shí)間為3 d。

酶活單位：使用國(guó)際單位（U），每小時(shí)產(chǎn)生1 mg葡萄糖為1個(gè)酶活單位[9]。

1.5　發(fā)酵條件優(yōu)化

1.5.1單因子試驗(yàn)

初始培養(yǎng)組分設(shè)定為：發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，pH 6.0，培養(yǎng)溫度30℃，接種量10%（V/V），在此基礎(chǔ)上分別改變碳源種類、混合碳源種類、氮源種類、碳氮比例、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、pH、接種量和金屬鹽，分別測(cè)定酶活力。

1.5.1.1碳源種類對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶影響

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中碳源分別按2.35%含量加入葡萄糖、蔗糖、玉米秸稈、MCC、CMC、麩皮和水稻秸稈，接種種子液，每個(gè)處理均重復(fù)3次，培養(yǎng)24 h后測(cè)定酶活力，下同。

1.5.1.2混合碳源對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶影響

選擇10種碳源，組成21種組合，兩種碳源以1∶1比例混合，按2.35%含量加入發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，確定最佳碳源組合。

1.5.1.3氮源種類對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶影響

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中使用已得最佳碳源組合，選擇10種氮源，按0.2%含量加入其中，得到最佳無(wú)機(jī)氮源和有機(jī)氮源。

1.5.1.4碳氮比例對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶影響

碳含量不變情況下，碳氮比例為9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1和2∶1加入發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，優(yōu)化最佳碳氮比例。

1.5.1.5培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶影響

將種子液加入發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12、24、36、48和60 h后測(cè)定酶活力。

1.5.1.6培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶影響

將種子液加入發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度分別設(shè)定為26、28、30、32、34和36℃，測(cè)定酶活力。

1.5.1.7初始pH對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶影響

用0.05 mol·L-1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制不同 pH（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 和7.5）發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，作為起始培養(yǎng)pH。

1.5.1.8接種量對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期種子液接種至100 mL發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，接種量分別設(shè)定為6%、8%、10%、12%和14%（V/V）。

1.5.1.9金屬鹽對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶影響

配制發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基時(shí)，金屬鹽分別加入2 g·L-1ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O、Fe（2SO4）3·7H2O、CoCl2·6H2O、FeCl3和CaCl2·6H2O，以不加金屬鹽為對(duì)照。

1.5.2正交試驗(yàn)法

根據(jù)單因子優(yōu)化結(jié)果，采用L1（837）正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果。

2　結(jié)果與分析

2.1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

縱坐標(biāo)為吸光值OD550，橫坐標(biāo)為葡萄糖含量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.6249x-0.0995，相關(guān)系數(shù)為R2=0.996＞0.99，說(shuō)明此標(biāo)準(zhǔn)曲線葡萄糖濃度和吸光值線性關(guān)系良好，通過(guò)測(cè)定樣品吸光值來(lái)計(jì)算葡萄糖濃度。

2.2　突變株篩選

2.2.1初篩

2.2.1.1UV誘變劑量確定

UV對(duì)菌株致死效應(yīng)和酶活力效應(yīng)分別見(jiàn)圖1和圖2。

圖1　UV誘變條件下菌株致死率Fig.1　Fatality rate by UV induced mutagenesis

圖2　UV誘變條件下突變菌株酶活力Fig.2　Enzyme activity of the mutant strain by UV induced mutagenesis

選取每個(gè)處理中水解圈最大單菌落突變株測(cè)定酶活。由圖1可知，隨UV對(duì)菌株處理時(shí)間延長(zhǎng)，致死率增大。當(dāng)致死率處于70%～90%時(shí)，正突變率較高。當(dāng)UV處理300 s時(shí)，菌株致死率為81.80%，此時(shí)酶活力最高為34.19 U·mL-1（見(jiàn)圖2），所有處理組中效果最佳，在UV誘變條件下，300 s為最佳誘變時(shí)間。

2.2.1.2DES誘變劑量確定

DES對(duì)菌株致死效應(yīng)和酶活力效應(yīng)分別見(jiàn)圖3和圖4。

圖3　DES誘變條件下菌株致死率Fig.3　Fatality rate by DES induced mutagenesis

圖4　DES誘變條件下突變菌株酶活力Fig.4　Enzyme activity of the mutant strain by DES induced mutagenesis

選取每個(gè)處理中水解圈最大單菌落突變株測(cè)定酶活。由圖3可知，隨DES對(duì)菌株處理時(shí)間延長(zhǎng)，致死率增大。當(dāng)DES處理40 min時(shí)，菌株致死率為81.32%，此時(shí)酶活力最高為35.60 U·mL-1（見(jiàn)圖4），為所有處理組中效果最佳，在DES誘變條件下，40 min為最佳誘變時(shí)間。

2.2.1.3NaNO2誘變劑量確定

NaNO2對(duì)菌株致死效應(yīng)和酶活力效應(yīng)分別見(jiàn)圖5和圖6。

圖5　NaNO2誘變條件下菌株致死率Fig.5　Fatality rate by NaNO2induced mutagenesis

圖6　NaNO2誘變條件下突變菌株酶活力Fig.6　Enzyme activity of the mutant strain by NaNO2induced mutagenesis

選取每個(gè)處理中水解圈最大單菌落突變株測(cè)定酶活。由圖5可知，隨NaNO2對(duì)菌株處理時(shí)間延長(zhǎng)，致死率增大。當(dāng)NaNO2處理10 min時(shí)，菌株致死率為83.07%，此時(shí)酶活力最高為35.22 U·mL-1（見(jiàn)圖6），為所有處理組中效果最佳，故在NaNO2誘變條件下，10 min為最佳誘變時(shí)間。

2.2.1.4UV與DES復(fù)合誘變劑量確定

UV與DES復(fù)合誘變對(duì)菌株致死效應(yīng)和酶活力效應(yīng)分別見(jiàn)圖7和8。選取每個(gè)處理中水解圈最大單菌落突變株測(cè)定酶活。由圖7可知，隨DES對(duì)菌株處理時(shí)間延長(zhǎng)，菌株致死率增大。當(dāng)DES處理40 min時(shí)，菌株致死率為80.30%，此時(shí)酶活力最高為37.37U·mL-（1見(jiàn)圖8），為所有處理組中效果最佳。

圖7　UV與DES復(fù)合條件誘變下菌株致死率Fig.7　Fatality rate by UV and DES induced mutagenesis

圖8　UV與DES復(fù)合條件誘變下突變菌株酶活力Fig.8　Enzyme activity of the mutant strain by UV and DES induced mutagenesis

2.2.1.5UV與NaNO2復(fù)合誘變劑量確定

UV與NaNO2復(fù)合誘變對(duì)菌株致死效應(yīng)和酶活力效應(yīng)分別見(jiàn)圖9和圖10。

圖9　UV與NaNO2復(fù)合條件誘變下菌株致死率Fig.9　Fatality rate by UV and NaNO2induced mutagenesis

圖10　UV與NaNO2復(fù)合條件誘變下突變菌株酶活力Fig.10　Enzyme activity of the mutant strain by UV and NaNO2induced mutagenesis

選取每個(gè)處理中水解圈最大單菌落突變株測(cè)定酶活。由圖9可知，隨NaNO2對(duì)菌株處理時(shí)間延長(zhǎng)，致死率增大。當(dāng)NaNO2處理10 min時(shí)，菌株致死率為78.56%，此時(shí)酶活力最高為38.20 U·mL-1（見(jiàn)圖10），為所有處理組中效果最佳。

由此可見(jiàn)，復(fù)合誘變效果要優(yōu)于單一UV、DES和NaNO2誘變效果。UV與NaNO2復(fù)合誘變下菌株酶活力大于UV與DES復(fù)合誘變下菌株酶活力，選取UV與NaNO2復(fù)合誘變后菌株開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.2復(fù)篩

經(jīng)10代繼代培養(yǎng)篩選出4株誘變菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)。結(jié)果見(jiàn)表1，不同菌株之間存在較大差異。方差分析（F=16.782，df=4，P＜0.01）顯示存在極顯著差異。M213菌株與出發(fā)菌株相比，纖維素酶活提高率最高為32.24%，選取M213菌株作產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)。

表1　復(fù)篩菌株與出發(fā)菌株纖維素酶活力比較Table 1　Comparison of cellulase enzyme activity between the rescreening strains and original strain

2.3　單因子對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶影響

2.3.1碳源種類對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶影響

碳源是纖維素降解真菌生長(zhǎng)必不可少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并影響其產(chǎn)酶能力。纖維素酶是誘導(dǎo)酶，不同碳源對(duì)纖維素酶產(chǎn)生不同誘導(dǎo)作用。如圖11所示，以葡萄糖、蔗糖、CMC、MCC、麩皮、水稻秸稈和玉米秸稈為底物，可見(jiàn)最佳碳源為麩皮，此時(shí)酶活力為38.01 U·mL-1，原因是麩皮含有足量木質(zhì)纖維素、淀粉和蛋白質(zhì)等物質(zhì)可在培養(yǎng)前期提供能源，使菌體生物量獲得一定積累后再利用木質(zhì)纖維素，獲得更多生物量。

圖11　碳源對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶影響Fig.11　Effects of carbon source on cellulase production

2.3.2混合碳源對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶影響

碳源滿足菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶需要可產(chǎn)生較多纖維素酶[10]。在21種碳源組合中（見(jiàn)表2），纖維素酶活有較大差異。纖維性碳源組合，如水稻秸稈、玉米秸稈和麩皮，產(chǎn)纖維素酶效果優(yōu)于可溶性碳源組合，如葡萄糖、蔗糖。其中麩皮/玉米秸稈酶活最高，其次是麩皮/水稻秸稈、玉米秸稈/水稻秸稈，其他組合酶活較低。原因一是纖維性碳源組合含有更復(fù)雜成分，如蛋白質(zhì)和維生素等對(duì)菌株產(chǎn)酶有利的生長(zhǎng)因子；二是纖維性碳源組合刺激菌體中纖維素酶系代謝加快。確定最佳碳源組合為麩皮和玉米秸稈，此時(shí)酶活力為39.15 U·mL-1。

2.3.3氮源種類對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶影響

不同氮源類型也是影響酶活力和產(chǎn)量重要因素，不同氮源會(huì)影響酶蛋白前體形成，從而調(diào)控酶合成[11]。本試驗(yàn)采用10種無(wú)機(jī)氮和有機(jī)氮，其對(duì)菌株產(chǎn)酶影響見(jiàn)圖12，（NH4）2SO4為最適無(wú)機(jī)氮源，酶活最高，為39.03 U·mL-1。蛋白胨為最適有機(jī)氮源，酶活為17.29 U·mL-1。不同氮源對(duì)酶活影響較大，無(wú)機(jī)氮比有機(jī)氮更利于產(chǎn)酶，無(wú)機(jī)氮中氨態(tài)氮比硝態(tài)氮更利于產(chǎn)酶，由于不同基團(tuán)氮代謝類型不同，NH4+可直接進(jìn)入菌體內(nèi)被迅速利用，而NO3-進(jìn)入細(xì)胞后，需要被還原成NH4+后才可被菌體利用。有機(jī)氮中蛋白胨酶活較高，試驗(yàn)中選擇相對(duì)廉價(jià)的豆餅粉[12]。因此，選擇（NH4）2SO4作為無(wú)機(jī)氮源代表，豆餅粉作為有機(jī)氮源代表。

表2　碳源組合對(duì)綠色木霉產(chǎn)纖維素酶影響Table 2　Effects of carbon source combinations on cellulase production of T.viride （U·mL-1）

圖12　氮源對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶影響Fig.12　Effects of nitrogen source on cellulase production

2.3.4碳氮比對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶影響

碳源和氮源比例是影響菌株生長(zhǎng)和酶合成重要因素之一，碳源濃度相對(duì)較高有利于菌株生長(zhǎng)，酶產(chǎn)量穩(wěn)定增加[13]；但碳源比重過(guò)高時(shí)，培養(yǎng)基內(nèi)無(wú)法正常換氣，含氧量不足，導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)受到嚴(yán)重影響，產(chǎn)酶量低。氮源比重過(guò)高，菌株生長(zhǎng)過(guò)快，無(wú)法有效積累代謝產(chǎn)物；相反如果氮源濃度不足，菌體無(wú)法快速生長(zhǎng)，影響酶產(chǎn)量。如圖13所示，當(dāng)碳氮比從9∶1減至7∶1時(shí)纖維素酶活力增加，隨比例下降酶活力降低，碳氮比7∶1時(shí)酶活最高，為39.34 U·mL-1。綜合考慮碳氮比為7∶1利于提高菌株酶活力。

圖13　碳氮比對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶影響Fig.13　Effects of carbon and nitrogen ratio on cellulase production

2.3.5培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶影響

將種子液接種于發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基后，生長(zhǎng)初期產(chǎn)酶量低，隨發(fā)酵時(shí)間變長(zhǎng)，產(chǎn)酶量越高，由圖14可知，培養(yǎng)24 h時(shí)酶活達(dá)最高值38.81 U·mL-1，但在培養(yǎng)24 h后隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)產(chǎn)酶量下降。最佳收獲酶時(shí)間為24 h。

圖14　培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶影響Fig.14　Effects of culture time on cellulase production

2.3.6培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶影響

培養(yǎng)溫度影響菌體生長(zhǎng)速度及產(chǎn)酶量。溫度較高和較低對(duì)菌株產(chǎn)酶均不利，溫度低時(shí)菌體生長(zhǎng)受抑制，產(chǎn)酶活力較低；溫度長(zhǎng)時(shí)間過(guò)高時(shí)，導(dǎo)致菌體死亡并影響產(chǎn)酶[14]。

由圖15可知，培養(yǎng)溫度30℃時(shí)，酶活力達(dá)峰值，為39.35 U·mL-1。溫度高于30℃后，酶活力降低。最適培養(yǎng)溫度為30℃。

圖15　培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶影響Fig.15　Effects of culture temperature on cellulase production

2.3.7初始pH對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶影響

pH通過(guò)影響細(xì)胞膜上電荷量產(chǎn)生，從而影響細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收?？煽刂婆囵B(yǎng)基中有機(jī)化合物離子化程度，間接控制有效分子進(jìn)入細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)或抑制微生物生長(zhǎng)[8]。pH影響酶穩(wěn)定性和活性。

由圖16可知，pH 3.5～6.0時(shí)，菌體生長(zhǎng)較好，酶活逐漸升高；pH＞6時(shí)，菌體生長(zhǎng)緩慢，酶活下降趨勢(shì)明顯。即當(dāng)pH=6時(shí)，最適產(chǎn)酶，酶活力為39.01 U·mL-1。因此該菌株適合在偏酸環(huán)境中生長(zhǎng)。

2.3.8接種量對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶影響

接種量影響菌株發(fā)酵產(chǎn)量[15]。由圖17可知，培養(yǎng)初期，接種量從6%～10%（V/V）時(shí)，酶活均呈上升趨勢(shì)；接種量＞10%（V/V）后，活性降低較快，由于菌體生長(zhǎng)速度過(guò)快，培養(yǎng)基內(nèi)含氧量降低，后期營(yíng)養(yǎng)不足引起產(chǎn)酶量下降[16-17]。當(dāng)接種量為10%（V/V）時(shí)，培養(yǎng)基內(nèi)菌體量適宜，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率最大，酶活為39.53 U·mL-1。

圖17　接種量對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶影響Fig.17　Effects of inoculation amount on cellulase production

2.3.9金屬鹽對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶影響

由圖18可知，最佳金屬鹽為Fe2（SO4）3·7H2O，酶活力為38.62 U·mL-1。FeCl3和MnSO4·H2O對(duì)酶活有促進(jìn)作用，該因素與以上優(yōu)化條件相比對(duì)產(chǎn)酶促進(jìn)作用較差，因此在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)酌情添加。

圖18　金屬鹽對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶影響Fig.18　Effects of metal salts on cellulase production

2.4　發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

結(jié)合單因子試驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)化多因素，見(jiàn)表3和4。

表3　正交因素水平Table 3　Factor and levels of orthogonal test method

表4　正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4　Results of orthogonal test

續(xù)表4

由表4可知，培養(yǎng)因素差異對(duì)纖維素酶活有顯著影響，RF＞RC＞RG＞RA＞RD＞RB＞RE，說(shuō)明影響菌株產(chǎn)酶主要因素為培養(yǎng)時(shí)間和碳氮比例，對(duì)菌株產(chǎn)酶影響最弱因素為溫度。菌株在中性或偏酸性條件下長(zhǎng)勢(shì)較好。從而得出產(chǎn)酶發(fā)酵最優(yōu)條件為A2B3C3D1E1F2G2，即：23.5 g·L-1麩皮和玉米秸稈，3 g·L-1（NH4）2SO4和豆餅粉，碳氮比8∶1，pH 5.5，培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時(shí)間24 h，接種量10%（V/V），酶活力48.42 U·mL-1。

3　討論與結(jié)論

多數(shù)研究側(cè)重測(cè)定綠色木霉適宜培養(yǎng)條件范圍，本文探討其最適發(fā)酵條件。胡立明等研究木霉和黑曲霉等產(chǎn)纖維素酶最適條件，最優(yōu)條件為初始pH 4.5～7.0，培養(yǎng)溫度28～32℃，發(fā)酵周期4～6 d[18-19]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，綠色木霉M213最適溫度30℃，最適pH 6.0，發(fā)酵周期3 d，與前人研究一致。綠色木霉M213具有更短發(fā)酵周期，在實(shí)際應(yīng)用中可減少生產(chǎn)成本，快速投入生產(chǎn)。

野生菌種酶活力較低，無(wú)法滿足工業(yè)生產(chǎn)要求，誘變育種是提高菌株酶活性和獲得工業(yè)生產(chǎn)菌株有效途徑[20-21]。本研究采用單因子及復(fù)合因子誘變方法，以綠色木霉AS3.3711為出發(fā)菌株，開(kāi)展UV、DES和NaNO2單因子誘變及UV和DES、UV和NaNO2復(fù)合誘變。本研究中，單一UV誘變下菌株酶活力為34.19 U·mL-1，單一NaNO2誘變下菌株酶活力為35.22 U·mL-1，單一DES誘變下菌株酶活力為35.60 U·mL-1，而UV和NaNO2復(fù)合誘變下菌株酶活力為38.20 U·mL-1，比單一UV誘變下菌株酶活力提高11.73%，比單一NaNO2誘變下菌株酶活力提高8.46%。結(jié)果表明，利用UV和NaNO2復(fù)合誘變可發(fā)揮兩種誘變劑協(xié)同作用，優(yōu)于單一誘變劑誘變效果，有效提高菌株產(chǎn)纖維素酶能力。梁亮等證明復(fù)合誘變效果優(yōu)于單因子誘變[22]。原因是單一誘變劑僅對(duì)菌株DNA某一個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)突變，誘變得到高產(chǎn)菌株易恢復(fù)突變，長(zhǎng)期使用誘變劑還會(huì)產(chǎn)生誘變劑“疲勞效應(yīng)”、菌種生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)、孢子量減少、代謝減慢等現(xiàn)象[10]。復(fù)合誘變具有協(xié)同效應(yīng)，正突變菌株遺傳比較穩(wěn)定，誘變效果明顯，通過(guò)影響DNA正常復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，使子代DNA形成缺口，堿基錯(cuò)誤插入該缺口，造成新鏈堿基序列與母鏈不同而使誘變提高菌株產(chǎn)酶活性[23]。在復(fù)合誘變中，UV和NaNO2復(fù)合誘變效果比UV和DES復(fù)合誘變效果好，表明UV和NaNO2復(fù)合誘變更有利于獲得高效產(chǎn)酶菌株。即不同組合復(fù)合誘變結(jié)果不同，各單因子相互作用影響誘變結(jié)果，部分誘變劑對(duì)所選菌株產(chǎn)生相同誘變效應(yīng)，菌株本身對(duì)不同誘變劑抵抗能力不同。

通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基條件提升菌株產(chǎn)酶效果，本研究中最適生長(zhǎng)時(shí)間和發(fā)酵時(shí)間相同，最適接種量和發(fā)酵接種量相同。不僅可降低菌體生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酶同步最優(yōu)化技術(shù)難度，還可簡(jiǎn)化實(shí)際生產(chǎn)操作流程。當(dāng)碳源為麩皮和玉米秸稈時(shí)酶活力比碳源為單一麩皮或玉米秸稈高，使用單一麩皮導(dǎo)致培養(yǎng)環(huán)境中無(wú)足夠空氣，加入纖維較粗玉米秸稈后，增強(qiáng)通氣性，利于菌絲生長(zhǎng)。鄭亞平等研究也發(fā)現(xiàn)，不同碳源對(duì)纖維素酶誘導(dǎo)作用不同，使用多種碳源誘導(dǎo)效果更好[24]。

本研究中M213菌株在最優(yōu)液體發(fā)酵條件下纖維素酶酶活力可達(dá)48.42 U·mL-1，是優(yōu)化前（40.02 U·mL-1）1.21倍，是野生菌株（30.40 U·mL-1）1.59倍，產(chǎn)酶活力較蘭時(shí)樂(lè)等分離綠色木霉突變株酶活力高[25]。因此，利用復(fù)合誘變方法選育綠色木霉具有可行性。綠色木霉M213菌株培養(yǎng)與發(fā)酵周期短、產(chǎn)纖維素酶活性高，具有重要開(kāi)發(fā)價(jià)值。