杜志強，董翔宇，汪禮建，高卓然，李　輝

（1.農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點實驗室，哈爾濱　150030；2.黑龍江省高校動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，哈爾濱　150030；3.東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，哈爾濱　150030）

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是近年新發(fā)現(xiàn)的一類長度大于200個核苷酸，缺乏蛋白編碼功能，由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ轉(zhuǎn)錄生成的RNA[1]，可多層面調(diào)控轉(zhuǎn)錄后和表觀生物學等過程[2-4]。起初，lncRNA被視為轉(zhuǎn)錄過程中的“轉(zhuǎn)錄噪音”。隨后研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA可作為生物信號分子、miRNA吸附“海綿體”、轉(zhuǎn)錄因子引導者、增強子及蛋白支架等，參與轉(zhuǎn)錄本可變剪接、基因組印記、染色體沉默、細胞周期調(diào)控、蛋白質(zhì)合成等生物學過程[5-6]。

NRON是抑制NFAT（Nuclear factor of activated T cells，活化T細胞核因子）的lncRNA[7]，最初是在一個表達序列標簽（EST）測序項目中，通過篩選512個保守非編碼RNA序列而被找到[8-9]。NFAT是一類轉(zhuǎn)錄因子家族，在免疫反應中對誘導基因轉(zhuǎn)錄起重要作用[10]。除T細胞外，免疫細胞多可表達該類蛋白質(zhì)[11]，如B淋巴細胞[12]、肥大細胞、嗜酸性粒細胞等；NFAT也影響心肌、骨骼肌及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[9]。此外，NFAT與脂肪細胞分化有關[13-14]。鈣離子依賴的鈣調(diào)蛋白磷酸酶調(diào)節(jié)NFAT活性[15-16]。隨細胞內(nèi)鈣水平升高，鈣調(diào)磷酸酶（Cn）被激活，直接脫磷酸以過磷酸化形式存在于NFAT蛋白，誘導其轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)。轉(zhuǎn)移至核內(nèi)NFAT蛋白結(jié)合于靶基因啟動子上，單獨或與其他轉(zhuǎn)錄因子共同誘導基因表達。與鈣調(diào)磷酸酶激活通路拮抗的NFAT激酶、糖原合成酶激酶（GSK）、酪蛋白激酶（CK），使NFAT蛋白磷酸化，從核內(nèi)轉(zhuǎn)出至細胞質(zhì)[17]。NRON則通過與NFAT形成RNA-蛋白復合物形式調(diào)節(jié)NFAT脫磷酸作用[18]，參與艾滋病病毒HIV-1復制過程[19-20]。目前，雞NRON功能研究國內(nèi)外無相關報道。

本研究以東北農(nóng)業(yè)大學肉雞腹脂雙向選擇系和愛拔益加（Arbor acres，AA）肉雞群體為材料，檢測NRON單核苷多態(tài)性，進一步分析其同生長性狀間關聯(lián)，旨在探討NRON基因影響肉雞肌肉和脂肪組織生長發(fā)育分子機制。

1　材料與方法

1.1　材料

東北農(nóng)業(yè)大學肉雞高、低腹脂雙向選擇品系（NEAUHLF）經(jīng)21個世代選育，高、低脂系間腹脂重和腹脂率差異顯著。本研究以NEAUHLF第19世代雞群和AA肉雞隨機群體為試驗材料，選用高脂系公雞114只，低脂系公雞121只，AA群體公雞母雞共240只，收集各類生長性狀：肉雞1～7各周齡體重，7周齡屠宰時胴體性狀。

組織表達檢測樣品采集過程如下：從高、低脂系第19世代（G19）肉雞出生后1周齡開始取組織樣品，每周采樣一次，直至7周齡。取樣分為兩組：高脂系公雞和低脂系公雞。禁食10 h后稱量體重并屠宰，屠宰后稱量腹脂重，計算腹脂率（腹脂重/體重）。采集腹脂、大腦、肝臟、腎臟、脾臟、心臟、肌胃、腸系膜周圍脂、皮下脂、肌胃周圍脂共10種組織。樣品于0.75%氯化鈉中清洗，液氮中速凍，-80℃保存待用。

1.2　方法

1.2.1引物設計與合成

1.2.1.1Real-Time RT-PCR引物設計

根據(jù)Ensembl數(shù)據(jù)庫中雞NRON基因序列（ENSGALG00000025631）和NFAT基因序列（ENSG ALG00000039300），結(jié)合內(nèi)含子位置信息，選擇Primer Premier 5.0設計Real-Time RT-PCR表達檢測引物。內(nèi)參基因TBP根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫信息，使用Primer Premier 5.0設計引物。引物信息見表1。

1.2.1.2酶切引物設計

根據(jù)Ensembl數(shù)據(jù)庫雞NRON基因序列（ENS?GALG00000025631），利用在線軟件WatCut(http://watcut.uwaterloo.ca/)及Primer Premier 5.0設計酶切引物（見表2）。

表1　Real-Time RT-PCR表達檢測引物Table 1　Primers for Real-Time RT-PCR

表2　酶切引物Table 2　Primers for restriction enzyme cleavage

1.2.2RNA提取及cDNA合成

高、低脂系肉雞（各5只），分別提取組織總RNA（TRIZOL法），通過瓊脂糖凝膠電泳分析，Nano?drop檢測濃度，確保DNA和RNA質(zhì)量和完整性。

取1 mL TRIZOL加入研磨（液氮中）組織樣品50～100 mg，充分混勻。加入0.2 mL氯仿，離心后，水相轉(zhuǎn)移到新離心管。加入400 mL異丙醇沉淀水相中RNA，離心后移去上清。加入1 mL DEPC處理的75%乙醇洗滌，RNA沉淀后移去上清，DEPC水溶解RNA。-80℃冰箱備用。利用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser（購自TaKaRa寶生物公司）獲得去除基因組cDNA。

1.2.3Real-Time RT-PCR

Real-Time RT-PCR反應體系為：SYBR?Pre?mix Ex TaqTM（2×）（購自寶生物工程（大連）有限公司）5μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.2μL，上、下游引物10μmol·L-1各0.2μL，cDNA模板1μL，ddH2O 3.4μL，總體積10μL。反應條件：95℃預變性10 s，95℃變性5 s，60℃復性延伸34 s，共40個循環(huán)。溶解曲線95℃15 s，60℃ 10 min，95℃15 s，每個樣品設3孔重復。使用Real-Time RT-PCR儀型號為ABI 7500。

1.2.4PCR擴增

根據(jù)設計SNP1和SNP2基因作PCR擴增，PCR擴增體系為：50 ng·μL-1基因組 1 μL，10×PCR Buffer 0.8 μL，10 mol·μL-1上游引物0.2 μL，10 mol·μL-1下游引物 0.2 μL，10 mmol·μL-1dNTP 0.8 μL，Taq DNA 聚合酶0.1 μL，去離子滅菌水6.7 μL。

PCR擴增程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，（55.7～60.7 ℃） 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；72℃7 min。PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳檢測，以5μL DNA Marker DL 2000為參照。電泳結(jié)束后利用凝膠成像系統(tǒng)觀察擴增結(jié)果。

NRON基因變異位點可被限制性內(nèi)切酶切割，選用限制性片段長度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphisms，RFLP）分型方法。

酶切體系設計為：內(nèi)切酶10 U·μL-10.1 μL，10·Buffer 2.0 μL，PCR產(chǎn)物0.3～0.5 μg，去離子水加至20 μL。

將上述反應液混勻，于適當溫度（依據(jù)不同酶而定）水浴中過夜消化，將全部反應液作瓊脂糖凝膠電泳，檢測PCR產(chǎn)物酶切效果及片段多態(tài)性。酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并觀察結(jié)果。

1.2.6基因效應分析

根據(jù)群體特點，構(gòu)建基因型分析統(tǒng)計模型：

其中，Y為性狀觀測值，μ為群體均值，G為基因型固定效應，L為品系固定效應，G×L為基因型和品系互作效應，F(xiàn)（L）為品系內(nèi)家系隨機效應，D（F,L）為家系與品系內(nèi)母雞隨機效應，S為性別固定效應，G×S為基因型和性別互作效應，F(xiàn)為家系隨機效應，D（F）為家系內(nèi)母雞隨機效應，BW（第1或第7周齡體重）為協(xié)方差變量，e為隨機效應。

模型①適于東北農(nóng)業(yè)大學高、低脂系肉雞雙向選擇系群體，模型②適于AA肉雞隨機群體；使用統(tǒng)計軟件JMP 7.0檢驗基因型與性狀間相關性，估計性狀最小二乘均值。P＜0.05為顯著，P＜0.01為極顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1　雞NRON基因多態(tài)性檢測

2.1.1SNP位點發(fā)現(xiàn)

在婚姻中，不要試圖改造或改變伴侶。人無完人，每個人身上都存在優(yōu)點，也存在缺點。當初，你之所以選擇和對方結(jié)婚，肯定是因為對方身上有你欣賞的地方，不妨學會欣賞對方的優(yōu)點，忽略對方的缺點。一個善解人意的妻子或丈夫，應該尊重對方的個性，不要把自己的意志強加給對方，要給對方保留一定的自由空間，允許對方有自己的社交圈子。

本試驗根據(jù)19世代高、低脂系肉雞全基因組重測序數(shù)據(jù)（未發(fā)表結(jié)果），發(fā)現(xiàn)NRON基因上下游共10個單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點。為進一步確定SNP真實性，根據(jù)Ensemble數(shù)據(jù)庫中雞NRON序列（ENSGALG00000025631），隨機選取19世代高、低脂系肉雞各3個基因組樣本為模板，設計3段引物及PCR方法擴增長度分別為898、891和837 bp序列（覆蓋2 757 bp，包括NRON基因和其上下游各1 200 bp序列）。PCR產(chǎn)物測序后與雞基因組（Gallus 5.0）比對分析，驗證10個SNP，后續(xù)關聯(lián)分析使用其中兩個SNP位點，1個位于NRON基因，另1個位于NRON基因下游。具體SNP位置信息如圖1所示。

圖1　NRON基因SNP相對位置信息Fig.1　Relative positions of SNPs discovered in NRON

2.1.2多態(tài)性檢測及分析

采用SNP-RFLP技術檢測NRON基因兩個SNP位點，高、低脂肉雞和AA肉雞群體中分別檢測3種基因型。檢測NRON基因多態(tài)性PCR擴增片段產(chǎn)物長度分別為 217 bp（SNP1）和 202 bp（SNP2）。SNP1片段經(jīng)SspⅠ限制性內(nèi)切酶酶切后產(chǎn)生長度為143 bp和74 bp片段，根據(jù)條帶不同分別檢測3種基因型，分別命名為GA基因型（217 bp+143 bp+74 bp）、AA基因型（143 bp+74 bp）和GG基因型（217 bp）；SNP2片段經(jīng)EaeⅠ限制性內(nèi)切酶酶切后產(chǎn)生長度為166 bp和36 bp片段，根據(jù)條帶不同分別檢測到3種基因型，分別命名為GG基因型（202 bp）、CC基因型（166 bp+36 bp）和GC基因型（202 bp+166 bp+36 bp）（見圖2）。

關聯(lián)分析結(jié)果見表3～4，AA肉雞群體中，SNP1位點與生長性狀無關聯(lián)，SNP2位點與心臟重、3周齡和5周齡顯著相關。高、低脂系肉雞群體中，SNP1位點與肌胃重、骨盆寬、胸角性狀顯著相關，SNP2位點與心臟重、腺胃重、胸寬性狀顯著相關。同時，AA肉雞群體中，雖然SNP2位點多態(tài)性與腹脂重不相關，但顯性效應值大于加性效應值，且顯性度為1.3，表明SNP2位點有超顯性且影響腹脂重；高、低脂系肉雞群體中，SNP2位點與胸寬性狀顯著相關，且顯性效應值大于加性效應值，顯性度為12.9，表明SNP2位點有超顯性且影響胸寬；但在兩個群體中，心臟重顯性度均不明顯。

2.2　連鎖不平衡分析

以東北農(nóng)業(yè)大學肉雞高、低脂雙向選擇品系第19世代資源群體（G19）235只公雞和AA群體240只公雞和母雞為試驗材料，Haploview軟件分析SNP1和SNP2在兩個群體間連鎖不平衡關系。結(jié)果表明，AA肉雞群體中，SNP1和SNP2位點間連鎖不平衡程度較強（D'=1.0）（見圖3a）；而高、低脂系肉雞群體中，SNP1與SNP2幾乎不連鎖（D'=0.03，見圖3b）。

圖2　NRON基因SNP多態(tài)片段產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果Fig.2　Gel electrophoresis of NRON SNP RFLP

表3　AA肉雞群體NRON基因SNP多態(tài)性與生長性狀關聯(lián)分析Table 3　Association of NRON polymorphisms with growth traits in AA broilers

表4　高、低脂系肉雞群體中NRON基因SNP多態(tài)性與生長性狀關聯(lián)分析Table 4　Association of NRON polymorphisms with growth traits in HLF broilers

圖3　AA和高、低脂系肉雞群體中NRON SNP連鎖不平衡分析Fig.3　Linkage disequilibrium analysis of NRON SNPs in AA and HLF broilers

2.3　在不同組織中雞NRON基因表達規(guī)律

Real-Time RT-PCR檢測NRON基因高、低脂系肉雞腹部脂肪組織表達情況（n=5）。

由圖4可知，1、4、7周齡，NRON基因在肉雞高脂系表達水平顯著高于低脂系（P＜0.05）；且NRON及NFAT基因隨周齡增加，表達量呈遞增趨勢。

同時，檢測NRON基因在高、低脂肉雞心臟、腺胃、肌胃、胸肌、肝臟、睪丸、脾臟組織中表達情況（n＝3）。

由圖5可知，NRON基因在睪丸和脾臟組織中不表達；肌胃、肝臟中表達差異不顯著；心臟、腺胃、胸肌中表達差異極顯著（P＜0.01），且在心臟和腺胃中，高脂系顯著高于低脂系，胸肌中，高脂系顯著低于低脂系。

圖4　 雞脂肪組織中NRON及NFAT的mRNA表達水平Fig.4　mRNA expression patterns of NRON and NFAT in abdominal adipose tissues

圖5　 雞不同組織中NRON的mRNA表達水平Fig.5　mRNA expression patterns of NRON in different tissues

3　討論與結(jié)論

3.1NRON和NFAT與心臟發(fā)育

本研究發(fā)現(xiàn)NRON與肉雞心臟重極顯著相關，高、低脂系肉雞中，NRON基因在心臟中表達差異極顯著，高脂系表達顯著高于低脂系。研究表明NFAT基因為調(diào)控心房肌生長發(fā)育重要因子，其功能紊亂導致心臟疾病，在人類心臟表達基因中，13%在啟動子區(qū)有NFAT結(jié)合位點，這些基因中20%～40%在心臟病發(fā)病前期發(fā)生表達修飾[21]。NFAT激活由鈣調(diào)磷酸酶介導，對于肥厚心肌組織中心肌細胞基因表達有重要作用[22]，Putt等研究表明NFAT是心肌肥大反應調(diào)節(jié)元件[23]。在心肌肥大心臟中，NFAT脫磷酸化增強自身核定位和轉(zhuǎn)錄活性[24-25]，導致NFAT活性在患心臟病或年老患者中均明顯增強[26]。同時，抑制NFAT基因活性可干擾心肌肌鈣蛋白基因轉(zhuǎn)錄過程，導致心房肌變薄[10]。NRON基因作為NFAT抑制物[9]，作為一種新生物標記可預測心臟病[27]。NRON可作研究肉雞心臟生長發(fā)育過程標記基因。

3.2　NRON與肌肉生長發(fā)育

除與心臟生長發(fā)育密切相關外，NRON與肉雞其他生長性狀（3周齡重、5周齡重、腺胃重、胸寬）也顯著相關（P＜0.05）。高脂系胸肌中NRON表達水平顯著低于低脂系。NRON基因表達研究表明，在人胎盤組織、胸腺、脾臟中NRON高豐度表達，在睪丸、腎臟、大腦和腎上腺組織中也檢測到NRON基因較高豐度表達[9]。小鼠骨骼肌、胸腺中NRON基因高豐度表達，脾臟、淋巴組織和肺組織也可檢測明顯表達[9]。NRON基因Northern雜交結(jié)果同其基因表達結(jié)果吻合，且NRON轉(zhuǎn)錄本在不同組織中有特異性剪接形式，可能有其他未知生物學功能[9]。研究結(jié)果暗示NRON與骨骼肌和平滑肌生長發(fā)育可能相關。因此，NRON基因與肉雞體重等生長性狀顯著相關，胸肌中差異表達，因此可能被作為重要生產(chǎn)性狀候選基因，應用于分子育種和肉雞生產(chǎn)。

3.3　NRON與脂肪組織生長發(fā)育

NRON及NFAT基因在東北農(nóng)業(yè)大學高、低脂系肉雞腹部脂肪組織中表達差異顯著（P＜0.05），表達趨勢一致，均為肉雞高脂系中mRNA表達水平高于低脂系。NFAT轉(zhuǎn)錄因子家族源自REL（c-Rel）-nuclear factor-κB（REL-NF-κB）轉(zhuǎn)錄因子家族[28]，被認定為活化T細胞中重要組成因子，其受鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)特性決定NFAT在多種生物過程均有調(diào)節(jié)功能[29-31]，如非免疫細胞生成[32-33]，心肌形成[34-36]和神經(jīng)回路[36]等。最初并未發(fā)現(xiàn)NFAT與脂肪生成相關[14,30]，近期Graef等研究發(fā)現(xiàn)其在脂肪細胞分化過程中具有重要作用[37-39]。NFAT可與轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強子結(jié)合蛋白互作形成復合元件[38-39]，調(diào)節(jié)脂肪生成重要調(diào)節(jié)因子過氧化物酶增殖體受體γ2（PPARγ2）基因表達[40-41]，參與脂肪生成；此外，NFAT與脂肪酸結(jié)合蛋白（aP2）同樣有關[42-43]，在小鼠3T3-L1前脂肪細胞中，NFAT蛋白結(jié)合aP2啟動子并反式調(diào)控aP2轉(zhuǎn)錄過程，影響脂肪細胞分化[44]。

作為脂肪生成重要調(diào)控因子，去乙?；窼IRT1不僅結(jié)合NF-κB使其去乙?；?，抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄激活活性[45]，還抑制NFAT活性[46]，抑制脂肪生成。NFAT與脂肪分化標志基因脂聯(lián)素密切相關。NFAT家族成員NFAT3/c4通過結(jié)合脂聯(lián)素啟動子區(qū)，激活脂聯(lián)素啟動子活性，調(diào)控其在小鼠3T3-L1脂肪細胞中表達[47]。綜上，NFAT可通過多種分子機制促進脂肪細胞分化，NRON則通過抑制NFAT脫磷酸化而促進脂肪分化過程。

3.4　NRON功能性SNP鑒定

通過連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)NRON基因中SNP1和SNP2位點在高、低脂系肉雞群體中連鎖不平衡程度較強，且兩個位點與生產(chǎn)性狀關聯(lián)分析結(jié)果不同。通過轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點在線預測，發(fā)現(xiàn)NFAT蛋白結(jié)合NRON序列十分接近SNP1（未發(fā)表結(jié)果）。表明SNP1位點可能影響NRON與NFAT形成RNA-蛋白復合物，參與NRON調(diào)控NFAT功能分子生物學過程。本研究僅檢測NRON基因單核苷酸多態(tài)性位點與生產(chǎn)性狀間相關及組織中表達情況，需進一步開展SNP功能性鑒定和相關作用機制分析，揭示NRON與肌肉和脂肪性狀間分子調(diào)控機制。