朱延明，杜建英，陳　超，于　洋，孫曉麗，丁曉東，殷奎德，王子君，朱娉慧

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物基因工程實驗室，哈爾濱　150030；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江　大慶　163319）

植物蔗糖非發(fā)酵-1-型相關(guān)蛋白激酶-1（Sucrose non-fermenting-1-related protein kinases-1,SnRK1）進化高度保守，是植物碳氮代謝主要調(diào)控因子。植物中SnRK1蛋白激酶在序列和功能上與酵母碳源調(diào)控蛋白激酶SNF1（Sucrose non-fermenting-1 kinase）和動物AMPK（AMP-activating protein kinase）蛋白激酶同源性較高。Alison等發(fā)現(xiàn)黑麥中屬于SnRK1亞家族的蛋白激酶可互補SNF1在酵母中利用非葡糖碳源功能[1]。SnRK1是由α、β、γ組成的異源復(fù)合體，在植物激素ABA信號傳導(dǎo)、能量和代謝調(diào)控等過程中起調(diào)控中樞作用[2]。研究證明，與SNF1和AMPK相比，植物中SnRK1功能多樣性廣泛。Ruslana等研究報道，SnRK1蛋白激酶廣泛參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，MYBS類轉(zhuǎn)錄因子，在植物激素（ABA、細(xì)胞激動素、生長素和乙烯）信號途徑中扮演關(guān)鍵角色，豌豆VfSnRK1在協(xié)調(diào)ABA和生長素之間關(guān)系中起重要作用，參與細(xì)胞激動素信號傳導(dǎo)途經(jīng)[3]。

關(guān)于SnRK1在耐鹽或耐堿方面調(diào)控作用，在植物方面未見報道。酵母研究方面，當(dāng)酵母中SNF1（SnRK1同源基因），或者其上游激酶（Sak1、Tos3和Elm1）被敲除時，酵母突變株系表現(xiàn)對鹽和pH高度敏感[4-5]，說明該激酶在酵母耐鹽堿非生物脅迫中起關(guān)鍵作用，是本研究探索GsSnRK1.1和GsGRIK1互作行使耐堿功能理論基礎(chǔ)；在植物方面，Grahame等研究表明，SnRK1直接調(diào)控多種非生物脅迫（鹽脅迫、高溫脅迫和干旱脅迫）相關(guān)基因表達(dá)[6]。擬南芥與鹽和缺氧（Hypoxia）有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子AtMYC2是SnRK1磷酸化底物，AtMYC2被SnRK1磷酸化后會經(jīng)蛋白酶體途徑降解，說明SnRK1在植物抗鹽脅迫途徑中起調(diào)控作用[7]。

進一步了解GsSnRK1.1上游激活因子，是揭示GsSnRK1.1蛋白激酶新功能關(guān)鍵。Sugden等提出植物SnRK1上游激活激酶存在[8]，Wang等報道擬南芥GRIK1和GRIK2（分別稱為SNAK2和SNAK1）是與酵母SAK1、TOS3、ELM1和哺乳動物L(fēng)KB1和CaM?KKb有關(guān)同源基因[9]。每個GRIK蛋白均可使酵母三重突變體（sak1、tos3和elm1）在非葡萄糖培養(yǎng)基上正常生長[10-11]。結(jié)果表明，GRIKs是植物中SnRK1上游激活因子。為驗證這一假說，Wei等研究發(fā)現(xiàn)擬南芥GRIK1和GRIK2可磷酸化激活SnRK1，而GRIK1（Geminivirus rep-interacting kinases1）是應(yīng)答細(xì)胞外病毒侵害的蛋白激酶，說明植物中SnRK1上游因子具有功能多樣性[12]。在非生物脅迫方面，GRIK1磷酸化激活SnRK1家族蛋白激酶響應(yīng)鹽脅迫，且在多重信號通路中起重要作用[13]。但在GRIK1與SnRK1是否參與植物抵御堿脅迫方面，尚無相關(guān)研究，本試驗針對這一問題開展研究，進一步研究野生大豆GsGRIK1與GsSnRK1互作分子機制。

綜上所述，為揭示堿脅迫應(yīng)答基因GsSnRK1.1與上游調(diào)控因子GsGRIK1在野生大豆中互作功能，本研究克隆GsGRIK1和GsSnRK1.1，并通過組織染色和堿處理超量表達(dá)目的基因大豆發(fā)狀根表型分析作功能驗證，證明GsGRIK1和GsSnRK1.1具有顯著耐堿功能；通過生物信息學(xué)軟件NCBI和Clust?alX 2.0分析，表明GsGRIK1屬于類鈣調(diào)蛋白激酶；利用酵母突變體系統(tǒng)分析證明GsGRIK1和GsSnRK1.1存在互作關(guān)系；進一步采用Western blot生化分析證明，GsGRIK1通過鈣離子依賴途徑磷酸化激活GsSnRK1.1；通過組織染色分析GsGRIK1和GsSnRK1.1在堿脅迫下表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)其顯著響應(yīng)堿脅迫；通過發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化對大豆毛狀根表型分析表明，野生大豆中GRIK1與SnRK1參與植物抵御堿脅迫。為揭示GsSnRK1及其上游調(diào)控激酶功能和分子調(diào)控機制奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料

耐鹽堿東北野生大豆（Glycine soja）Gs07256、栽培大豆（Glycine max L.Merr）東農(nóng)50種子、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、發(fā)根農(nóng)桿菌（Ag.rhizo?genes）K599、酵母表達(dá)載體（PYX212和PYX242）以及植物表達(dá)載體pCAMBIA1302，均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物基因工程實驗室保存。酵母菌株Msy182（WT）、Msy1193（snf1 Martin）及 Msy923（sak1/tos3/eml1/snf1 Matin，his,ura/TRP/leu）均由哥倫比亞大學(xué)提供。膠回收和質(zhì)粒小提試劑盒購自Transgene公司，引物合成及測序由哈爾濱英俊生物公司及金唯智生物科技有限公司完成。

1.2　方法

1.2.1 GsSnRK1.1與GsGRIK1基因克隆與序列分析

基因克隆：根據(jù)野生大豆GsSnRK1.1與Gs?GRIK1基因cDNA全長序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計基因特異PCR引物（見表1）。以野生大豆cD?NA為模板，利用PrimeSTAR?HS DNA聚合酶PCR擴增獲得目的基因全長CDS區(qū)[14-15]。根據(jù)PCR產(chǎn)物對照Marker位置回收目的條帶。

序列分析：利用NCBI軟件對GsSnRK1.1與GsGRIK1在線Blast序列比對，分析其基因結(jié)構(gòu)。對野生大豆、栽培大豆和擬南芥中GsGRIK1同源基因，利用ClustalX 2.0作多重序列比對，參數(shù)設(shè)定為默認(rèn)值[16-17]。

1.2.2酵母突變體表型試驗

酵母表達(dá)載體構(gòu)建：根據(jù)目的基因序列，設(shè)計目的基因及其突變體引物（見表1），利用OVER?LAP PCR方法擴增目的基因突變體序列，得到GsSnRK1.1-T179A、GsSnRK1.1-T179E、GsSnRK1.1-K49M及GsGRIK1-K146A基因片段。將GsSnRK1.1及其突變體酶切連接整合至酵母表達(dá)載體PYX212的Eco RⅠ和SalⅠ位點間，GsGRIK1及其突變體酶切連接至酵母表達(dá)載體PYX242的Eco RⅠ和SalⅠ位點間。

互補功能分析：利用TE-LiAC法，將含目的基因GsSnRK1.1及其突變體基因的重組載體、PYX212空載體（負(fù)對照）分別轉(zhuǎn)化至酵母突變體Msy1193（snf1）中，并以PYX212-GsSnRK1.1-T179E作為陽性對照，轉(zhuǎn)化菌株均涂布于單缺陷型酵母合成培養(yǎng)基（SD-Ura3）上，30℃恒溫箱內(nèi)倒置培養(yǎng)。挑選單菌落接種到約10 mL YPDA培養(yǎng)基中，于30℃恒溫震蕩培養(yǎng)24～36 h，收集菌體，將菌液用無菌水稀釋至OD600=0.25，梯度（1/10、1/100、1/1 000）稀釋。分別取1 μL Msy1193轉(zhuǎn)化子菌液點樣至不同碳源（葡萄糖、甘油、乙醇）單缺陷型酵母合成培養(yǎng)基（SD-Leu2）上，30℃恒溫箱內(nèi)倒置培養(yǎng)。每組3個生物學(xué)重復(fù)，拍照記錄。

互作功能驗證試驗：將含目的基因GsSnRK1.1、GsGRIK1及其突變體基因重組載體共轉(zhuǎn)化至Msy923（sak1/tos3/eml1/snf1）中，并以 PYX212/PYX242空載體為負(fù)對照，將兩空載體轉(zhuǎn)化至Msy182（WT）作為陽性對照，轉(zhuǎn)化菌株均涂布于二缺陷型酵母合成培養(yǎng)基（SD-Leu2-Ura3）上，30℃恒溫箱內(nèi)倒置培養(yǎng)。挑選單菌落接種到約10 mL YPDA培養(yǎng)基中，于30℃恒溫震蕩培養(yǎng)24～36 h，收集菌體，將菌液用無菌水稀釋至OD600=0.25，再梯度（1/10、1/100、1/1 000）稀釋。分別取1 μL Msy923轉(zhuǎn)化子菌液點樣至不同碳源（葡萄糖、甘油、乙醇）和不同處理（9 mmol·L-1NaHCO3、1 mol·L-1NaCl、1 mol·L-1山梨醇、1 mol·L-1甘露醇）二缺陷型酵母合成培養(yǎng)基（SD-Leu2-Ura3）上，30℃恒溫箱內(nèi)倒置培養(yǎng)。每組3個生物學(xué)重復(fù)，拍照記錄。

1.2.3目的基因蛋白提取及生化分析

重組酵母細(xì)胞接種于50 mL YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，200 r·min-1，30℃震蕩培養(yǎng)36 h，達(dá)OD600≈3。分別取20 mL菌液低溫離心收集菌體。向離心管中加入1 mL裂解緩沖液（含1 μg蛋白酶抑制劑），加入一定量過夜酸洗玻璃珠，混勻后于旋渦振蕩儀上振蕩2 min，冰浴30 s，重復(fù)3次，4℃，12 000 r·min-1離心10 min，收集上清液。將上清液沸水浴5 min，-20℃保存待用。

Western blot生化分析：冰上凍融蛋白提取液，取一定體積樣本至新Eppengorf管中，加入8 μL 5×Protein Loading Buffer，沸水浴變性5 min，將樣本置于冰上并迅速上樣。按常規(guī)方法作SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，試驗樣本每道點樣5 μL，80 V電壓電泳2 h，然后將凝膠電泳樣品轉(zhuǎn)印至ECL膜上，70 V電壓轉(zhuǎn)膜2 h。采用脫脂奶粉封閉液封閉蛋白膜1 h，使用GsSnRK1.1特異磷酸化位點Thr179對應(yīng)的第一抗體Thr172（Phospho-AMPKα）孵育1 h，TBST洗膜3次，10 min·次-1。相對應(yīng)的第二抗體孵育1 h，TBST清洗3次，10 min·次-1。加DAB顯色后用Bandscan顯像分析[18]。

1.2.4大豆子葉發(fā)狀根誘導(dǎo)培養(yǎng)

利用趙曉雯等方法[19]，將氯氣滅菌大豆東農(nóng)50種子5 d萌發(fā)培養(yǎng)后，重組發(fā)根農(nóng)桿菌K599切割侵染大豆子葉，震蕩侵染30 min，將侵染后子葉節(jié)轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)基（1/10 B5培養(yǎng)基）中28℃暗培養(yǎng)3～4 d，再轉(zhuǎn)移至含200 mg·L-1阿莫西林-克拉維酸鉀的液體B5培養(yǎng)基中沖洗4～5次，除菌，隨后轉(zhuǎn)移至含200 mg·L-1阿莫西林-克拉維酸鉀的生根B5培養(yǎng)基上，20℃光照培養(yǎng)2周，待子葉葉柄處長出發(fā)狀根，用于后續(xù)試驗。

1.2.5GsSnRK1.1與GsGRIK1基因堿脅迫表達(dá)模式分析

根據(jù)GsSnRK1.1與GsGRIK1基因組序列，設(shè)計啟動子克隆引物（見表1），以野生大豆基因組DNA為模板，使用TaKaRa的Tks Gflex?DNA Polymerase作PCR擴增，整合至植物表達(dá)載體pCAMBIA3301上。將測序正確GsSnRK1.1與GsGRIK1啟動子植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至發(fā)根農(nóng)桿菌K599，侵染大豆子葉。對整合目的基因啟動子的3周齡大豆發(fā)狀根堿脅迫處理，堿脅迫處理溶液為含50 mmol·L-1NaH?CO3的B5溶液[20]，處理時間段為0、6和12 h，利用GUS組織化學(xué)染色法檢測處理后大豆發(fā)狀根[21]，3次生物學(xué)重復(fù)，拍照記錄。

1.2.6GsSnRK1.1與GsGRIK1基因超量表達(dá)大豆發(fā)狀根堿脅迫表型分析

根據(jù)GsSnRK1.1與GsGRIK1基因序列設(shè)計PCR擴增引物，GsSnRK1.1-SmaI-FW和GsSnRK1.1-SmaI-RV，GsGRIK1-SmaI-FW和GsGRIK1-SmaIRV（見表1），PCR擴增目的基因，將GsSnRK1.1與GsGRIK1通過酶切分步連接同一植物表達(dá)載體pCAMBIA1302。將測序正確的GsSnRK1.1與GsGRIK1基因植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至發(fā)根農(nóng)桿菌K599，使用K599重組菌株侵染大豆子葉。取長勢一致不同轉(zhuǎn)基因2周齡大豆發(fā)狀根，分別置于含30 mmol·L-1NaHCO3的B5培養(yǎng)基上，鹽脅迫和堿脅迫處理，繼續(xù)生根培養(yǎng)15～20 d。每天觀察其生長狀態(tài)，當(dāng)各樣品間表型差異明顯時拍照，統(tǒng)計其根長及發(fā)狀根鮮重并統(tǒng)計分析[22]。試驗3次生物學(xué)重復(fù)。以提取的處理樣品DNA為模板，運用基因特異性引物為模板檢測處理樣品，經(jīng)檢測均為陽性植株。

表1　所用引物Table 1　List of primers

2　結(jié)果與分析

2.1　GsSnRK1.1與GsGRIK1基因克隆與序列分析

根據(jù)GsSnRK1.1與GsGRIK1基因序列，設(shè)計基因特異引物，以野生大豆cDNA為模板，以PCR擴增方法克隆基因。通過測序結(jié)果分析，GsSnRK1.1基因長度為1 548 bp，編碼516個氨基酸（見圖1），受上游激酶調(diào)控的特異性磷酸化位點是第179位的蘇氨酸（Thr,T），其激活位點為第49位的賴氨酸（Lys,K）；GsGRIK1基因長度為1 215 bp，編碼415個氨基酸（見圖2），其激活位點為第146位的賴氨酸（Lys，K）。 通過NCBI在線Blast分析目的基因，結(jié)果表明GsSnRK1.1含有約255個氨基酸AMP?KA結(jié)合區(qū)域，位于第15～270位（見圖3A）。AMP?KA結(jié)構(gòu)域是廣泛存在于植物SnRK1家族蛋白中的一類高度保守結(jié)構(gòu)域。通過ClustalX序列比對發(fā)現(xiàn)GsGRIK1內(nèi)所含CaMKK結(jié)構(gòu)域高度保守（見圖4）。尤其是通過序列分析首次證明GsGRIK1屬于類鈣調(diào)蛋白激酶，含有約250個氨基酸CaMKK特異性結(jié)構(gòu)域，位于第130～375位（見圖3B），通過鈣離子依賴途徑調(diào)控下游蛋白，本試驗結(jié)果為國內(nèi)外首次報道。

圖1　GsSnRK1.1基因克隆Fig.1　Cloning of GsSnRK1.1 gene

圖2　GsGRIK1基因克隆Fig.2　Cloning of GsGRIK1 gene

圖3　GsSnRK 1.1與GsGRIK 1蛋白結(jié)構(gòu)分析Fig.3　Structural analysis of GsSnRK 1.1 and GsGRIK 1 protein

圖4　GRIK1家族序列分析Fig.4　GRIK1 family sequence analysis

2.2　GsSnRK1.1與SNF1功能互補分析

為揭示能否利用酵母突變株系統(tǒng)篩選GsSnRK1.1上游調(diào)控因子，利用酵母突變體MSY1193（snf1）探究GsSnRK1.1是否可互補酵母中同源基因SNF1功能。因為酵母中同源基因SNF1可調(diào)控酵母利用非葡糖碳源，使酵母在低葡萄糖或非葡萄糖條件下正常生長。由此，本研究將GsSnRK1.1及其突變體轉(zhuǎn)入MSY1193（snf1）中，將液體培養(yǎng)基活化的陽性轉(zhuǎn)化子在不同碳源單缺培養(yǎng)基（SD-Ura3）上作表型分析。結(jié)果表明，僅含GsSnRK1.1和GsSnRK1.1-T179E（陽性對照）的酵母細(xì)胞可在甘油和乙醇非葡糖碳源培養(yǎng)基上正常生長，而含GsSnRK1.1-T179A、GsSnRK1.1-K49M和空載體的陰性對照無法在非葡糖碳源培養(yǎng)基上正常生長（見圖5），說明野生大豆GsSnRK1.1可互補酵母中SNF1功能，酵母突變株系統(tǒng)可用于下一步研究。

圖5　GsSnRK1.1與SNF1功能互補分析Fig.5　Functional complementation assay of GsSnRK1.1 and SNF1

2.3 酵母中GsSnRK1.1與GsGRIK1互作表型分析

本研究利用酵母四重突變株MSY923（snf1/tos3/eml1/snf1），驗證GsGRIK1是否激活GsSnRK1.1，使其行使調(diào)控酵母利用非葡糖碳源功能。結(jié)果表明，僅含GsSnRK1.1和GsGRIK1酵母細(xì)胞以及含GsSnRK1.1-T179E和GsGRIK1-K146A的陽性轉(zhuǎn)化子，可在甘油和乙醇的非葡糖碳源培養(yǎng)基上正常生長，而其他組合酵母細(xì)胞無法在非葡糖碳源培養(yǎng)基上正常生長（見圖6），說明GsGRIK1可激活GsS?nRK1.1，使其行使調(diào)控酵母利用非葡糖碳源功能。

圖6　 酵母中GsSnRK1.1與GsGRIK1互作表型分析Fig.6　Interaction phenotype analysis of GsSnRK1.1 and GsGRIK1 in yeast

為進一步驗證GsSnRK1.1與GsGRIK1能否提高酵母耐逆境脅迫能力，將含有共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到不同脅迫處理培養(yǎng)基上，驗證非生物脅迫條件下GsGRIK1是否激活GsSnRK1.1，使其提高酵母耐逆境脅迫能力。發(fā)現(xiàn)僅含GsS?nRK1.1與GsGRIK1酵母細(xì)胞及含有GsSnRK1.1-T179E與GsGRIK1-K146A的陽性轉(zhuǎn)化子可在鹽堿脅迫以及模擬干旱脅迫培養(yǎng)基上正常生長，其他組合酵母細(xì)胞無法在脅迫處理培養(yǎng)基上正常生長（見圖7）。

結(jié)果說明，GsGRIK1調(diào)控GsSnRK1.1，使其行使提高酵母耐逆境脅迫功能。GsGRIK1與GsS?nRK1.1相互作用，能否提高植物耐逆境脅迫能力，需進一步驗證。

圖7　酵母中GsSnRK1.1與GsGRIK1多種脅迫下表型分析Fig.7　Phenotype analysis of GsSnRK1.1 and GsGRIK1 in yeast under some stresses

2.4　GsGRIK1調(diào)控GsSnRK1.1作用機制分析

通過序列分析發(fā)現(xiàn)，GsSnRK1.1第179位蘇氨酸是GsSnRK1.1激活位點，為探究GsGRIK1調(diào)控GsSnRK1.1作用方式，本研究采用檢測Thr179磷酸化的抗體Thr172（Phospho-AMPKα）作Western blot分析。結(jié)果表明，與未處理組相比，堿脅迫處理后提取蛋白樣品GsSnRK1.1磷酸化位點Thr179磷酸化程度明顯增加（見圖8A），說明GsGRIK1通過磷酸化GsSnRK1.1調(diào)控位點Thr179，激活蛋白激酶GsSnRK1.1激酶活性。

分析GsGRIK1序列，發(fā)現(xiàn)GsGRIK1可能是一類類鈣調(diào)蛋白激酶。為進一步了解GsGRIK1調(diào)控GsSnRK1.1分子機制，本研究對酵母陽性轉(zhuǎn)化子作堿脅迫（20 mmol·L-1NaHCO3，pH 8.5）處理和 Ca2+參與堿脅迫（20 mmol·L-1NaHCO3+20 mmol L-1CaCl2，pH 8.5）處理，作生化分析。發(fā)現(xiàn)有Ca2+參與的堿脅迫處理后GsSnRK1.1的Thr179位點磷酸化程度顯著增加（見圖8B）。結(jié)果表明，GsGRIK1上游調(diào)控因子GsGRIK1通過鈣離子依賴途徑磷酸化GsS?nRK1.1調(diào)控位點Thr179，調(diào)控蛋白激酶GsS?nRK1.1激酶活性。

2.5　GsSnRK1.1與GsGRIK1基因堿脅迫表達(dá)模式分析

為驗證GsSnRK1.1與GsGRIK1是否為堿脅迫應(yīng)答基因，本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法用K599侵染大豆子葉，獲得分別由GsSnRK1.1與GsGRIK1啟動子啟動GUS基因表達(dá)的大豆發(fā)狀根，堿脅迫（50 mmol·L-1NaHCO3，pH 8.5）處理后，采用 GUS組織化學(xué)染色法作表達(dá)模式分析。結(jié)果如圖9所示，堿脅迫處理的兩組樣品GUS基因表達(dá)量均有表達(dá)，未處理染色樣品未表達(dá)。由此表明，GsSnRK1.1與GsGRIK1可響應(yīng)堿脅迫。

圖8　GsSnRK1.1與GsGRIK1酵母中互作生化分析Fig.8　Biochemical analysis of the GsGRIK1 interaction with GsSnRK1.1 in yeast

圖9　GsSnRK1.1與GsGRIK1基因堿脅迫下表達(dá)模式分析Fig.9　GsSnRK1.1 and GsGRIK1 gene expression pattern analysis under alkali stress

2.6　GsSnRK1.1與GsGRIK1基因超量表達(dá)大豆發(fā)狀根鹽堿脅迫表型分析

為進一步闡明野生大豆GsSnRK1.1與GsGRIK1互作是否參與植物堿脅迫通路，通過堿脅迫處理超量表達(dá)GsSnRK1.1和GsGRIK1大豆毛狀根15 d，作功能表型鑒定及根長根重分析。發(fā)現(xiàn)超量表達(dá)GsSnRK1.1大豆發(fā)狀根根長與對照組相比，正常生長條件下根長較短，但在堿脅迫處理條件下根長較長，說明GsSnRK1.1參與植物抵御堿脅迫信號通路；與對照組野生型相比，共表達(dá)GsSnRK1.1和GsGRIK1大豆發(fā)狀根生長狀態(tài)與野生型一致，但發(fā)狀根數(shù)量較多；在30 mmol·L-1NaHCO3的B5培養(yǎng)基上，共表達(dá)GsSnRK1.1和GsGRIK1大豆發(fā)狀根與其他株系相比生長狀態(tài)最好，說明GsSnRK1.1和GsGRIK1互作顯著提高大豆發(fā)狀根對堿脅迫耐受性（見圖10A）；而共表達(dá)GsSnRK1.1和GsGRIK1-K146A與過表達(dá)GsSnRK1.1大豆發(fā)狀根生長狀態(tài)一致，且表型結(jié)果與圖10B、C根長根重分析結(jié)果一致。

以處理樣品中提取DNA為模板，運用基因特異性引物為模板檢測處理樣品，經(jīng)檢測均為陽性植株（見圖11）。表明GsSnRK1.1具有提高植物耐堿脅迫能力，受上游激活因子GsGRIK1調(diào)控，參與植物抵御堿脅迫信號通路。此結(jié)果可填補國內(nèi)外有關(guān)GsSnRK1.1和GsGRIK1互作提高植物對堿脅迫耐受性研究的空白。

圖10　GsSnRK1.1與GsGRIK1基因超量表達(dá)大豆發(fā)狀根堿脅迫表型Fig.10　Phenotype of GsSnRK1.1 and GsGRIK1 gene overexpression of soybean hair root under alkaline stress

圖11　GsSnRK1.1與GsGRIK1基因超量表達(dá)大豆發(fā)狀根PCR檢測Fig.11　PCR identification of GsSnRK1.1 and GsGRIK1 gene overexpression of soybean hair root

3　討論與結(jié)論

3.1　關(guān)于SnRK1耐鹽或耐堿功能

植物中SnRK1在能源信號傳導(dǎo)中起重要作用，且SnRK1可逆蛋白磷酸化是細(xì)胞信號響應(yīng)環(huán)境變化重要機制之一。耐鹽方面，SnRK1蛋白激酶可參與各種激素信號中樞傳遞，通過植物細(xì)胞信號傳導(dǎo)因子及調(diào)節(jié)機制使植物適應(yīng)多樣環(huán)境，如：鹽和缺氧（Hypoxia）脅迫[4]。SnRK1蛋白激酶在堿脅迫信號傳導(dǎo)中功能和調(diào)控機制未見報道。本研究通過表達(dá)模式分析、酵母突變株表型分析發(fā)現(xiàn)，GsSnRK1.1可積極響應(yīng)堿脅迫。堿脅迫處理大豆發(fā)狀根發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)GsSnRK1.1大豆發(fā)狀根根長顯著高于對照組，說明GsSnRK1.1可正向調(diào)控堿脅迫信號通路，提高植物耐堿性，GsSnRK1.1是功能顯著耐堿關(guān)鍵調(diào)控基因，可用于改良豆科植物耐鹽堿基因。正常條件下，過量表達(dá)GsSnRK1.1大豆發(fā)狀根根長較野生型短。Elena等研究發(fā)現(xiàn)，植物中SnRK1在脅迫和能源信號傳導(dǎo)中起調(diào)控中樞作用，但在正常條件下，過量表達(dá)AtSnRK1.1擬南芥植株比野生型植株矮?。缓诎岛蜐B透脅迫處理樣品中，過量表達(dá)AtSnRK1.1擬南芥植株生長狀況卻明顯優(yōu)于野生型植株。說明過量表達(dá)SnRK1可提高植株抵抗鹽堿和干旱環(huán)境能力[23]。

3.2　關(guān)于GsSnRK1.1與上游調(diào)控因子GsGRIK1互作功能

當(dāng)植物受病原菌侵害時，AtGRIK1（Geminivi?rus rep-interacting kinases 1）蛋白激酶磷酸化激活A(yù)tSnRK1，一方面通過調(diào)節(jié)植物新陳代謝相關(guān)基因，提高植物細(xì)胞對病毒抵御能力；另一方面激活被侵染細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，加速細(xì)胞凋亡，避免其他組織細(xì)胞感染病原菌[24]。但此前關(guān)于植物GRIK1調(diào)控SnRK1相關(guān)功能多限于參與抵御生物脅迫，在非生物脅迫方面少有報道。植物中AtGRIK1磷酸化激活A(yù)tSnRK1，可提高擬南芥對鹽脅迫抗性，上游調(diào)控因子GsGRIK1作用于GsSnRK1.1能否提高植物耐堿性未見報道。本研究中，通過酵母表型分析和生化分析發(fā)現(xiàn)，GsGRIK1可激活GsSnRK1.1提高酵母突變株耐鹽堿脅迫能力；通過表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，GsGRIK1和GsSnRK1.1參與植物響應(yīng)堿脅迫；且鹽堿脅迫處理轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)狀根，結(jié)果表明，在GsGRIK1與GsSnRK1.1共同作用下，可提高大豆發(fā)狀根對堿脅迫耐受性，說明野生大豆GsGRIK1通過激活調(diào)控GsSnRK1.1，參與植物響應(yīng)堿脅迫，提高植物耐堿性，通過Western blot生化分析，發(fā)現(xiàn)GsGRIK1通過鈣離子依賴途徑磷酸化激活GsS?nRK1.1，初步明確GsGRIK1與GsSnRK1.1作用方式與機理。相關(guān)研究僅限于其磷酸化作用，Gs?GRIK1活性調(diào)節(jié)未見報道。本研究可為GsGRIK1與GsSnRK1.1參與具體分子通路與作用機制研究奠定理論基礎(chǔ)。后續(xù)將深入研究GsGRIK1調(diào)控GsS?nRK1.1參與的具體分子通路，及其在野生大豆中相互作用生理生化機制。